Dokument: Entwicklung einer Real-Time PCR zur Detektion Vancomycin-resistenter Enterokokken (VRE)

Titel:	Entwicklung einer Real-Time PCR zur Detektion Vancomycin-resistenter Enterokokken (VRE)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23169
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20121121-120752-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Werner-Busse, Alexandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 292 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.11.2012 / geändert 21.11.2012
Beitragende:	Prof. Dr. MacKenzie, Colin [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Kobbe, Guido [Gutachter]
Stichwörter:	PCR, VRE, Enterokokken
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Enterokokken sind ubiquitär vorkommende, äußerst umweltresistente grampositive Kokken mit den wichtigsten humanpathogenen Vertretern Enterococcus faecium und Enterococcus faecalis. Ihre Bedeutung als Erreger nosokomialer Infekte steigt zunehmend; besonders immunsuprimierte Patienten sind gefährdet (Schaberg et al. 1991; Nelson 1999). Ist Vancomycin normalerweise ein potentes Antibiotikum zur Therapie enterokokkaler Infektionen, versagt es bei einer zunehmenden Zahl Vancomycin-resistenter Subtypen. Patienten, die mit Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE) infiziert oder kolonialisiert sind, müssen daher frühzeitig erkannt und gegebenenfalls isoliert werden; einerseits, um ihre Therapie im Infektionsfall frühzeitig anzupassen, andererseits, um die Ansteckungsgefahr für andere Patienten zu minimieren. Die aktuelle kulturelle VRE-Diagnostik ist mit 3-5 Tagen langwierig. Daher war der Ansatz dieser Arbeit, mithilfe einer Real-Time PCR eine Screeningmethode zu entwickeln, welche die Zeitspanne der Diagnostik auf wenige Stunden verkürzt. Hierfür wurden Rektalabstriche von hämatologisch-onkologischen Patienten des UKD untersucht. Als Zielgene wählten wir die häufigsten für Vancomycin-Resistenz kodierenden Sequenzen: vanA, vanB, vanC1 und vanC2,3. Um jede PCR auf potentielle Inhibitoren sowie Fehler bei der DNS-Aufbereitung überprüfen zu können, klonierten wir Positivkontrollen und eine Interne Kontrolle. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass die parallel durchgeführte mikrobiologische und molekularbiologische Diagnostik der Rektalabstriche divergente Ergebnisse ergab. Die PCR detektierte deutlich mehr VRE als die kulturelle Diagnostik: Von 178 Proben wurden 63 molekularbiologisch positiv auf VRE getestet, jedoch nur 15 in der kulturellen Diagnostik. Dies könnte einerseits mit einer höheren Sensitivität der PCR begründet werden (d.h., es können sehr kleine Mengen genetischen Materials detektiert werden), andererseits könnte es auch zur Detektion non-enterokokkaler van-Gene und damit falsch-positiver Resultate gekommen sein. Wir bebrüteten 19 Rektalabstriche, die unterschiedliche Ergebnisse gezeigt hatten, zur Unterdrückung von Begleitflora in VRE-Selektivbouillon und führten anschließend eine erneute PCR durch. In 14 von 19 Fällen zeigte die PCR hiernach keine Fluoreszenz mehr, es können also in diesen Fällen falsch-positive Resultate durch non-enterokokkale van-Gene angenommen werden. In 5 Patientenmaterialien konnten auch in der zweiten PCR VRE amplifiziert werden, sie wurden daraufhin einer biochemischen Differenzierung zugeführt. In vier der fünf Proben konnten Vancomycin-resistente Enterokokken nachgewiesen werden, der fünfte Rektalabstrich enthielt Leuconostoc mesenteroides, ein gram-positives Milchsäurebakterium, das ebenfalls Vancomycin-Resistenzen ausbilden kann (Patel 2000). Aufgrund der hohen Sensitivität von 93% könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Real-Time PCR als „Prä-Screening“ etabliert werden: Wird ein Patient negativ getestet, brauchen keine Isolationsmaßnahmen initiiert zu werden. Findet sich in der PCR eine positive Fluoreszenz, sollten entsprechende Isolations- und Hygienemaßnahmen sowie eine zusätzliche kulturelle Diagnostik eingeleitet werden. Ist diese negativ, kann die Isolation beendet werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	21.11.2012
Dateien geändert am:	21.11.2012
Promotionsantrag am:	09.03.2012
Datum der Promotion:	12.11.2012