Dokument: Die Bedeutung der JNK-Isoformen JNK1 und JNK2 für die Apoptose nach proteasomaler Inhibition

Titel:	Die Bedeutung der JNK-Isoformen JNK1 und JNK2 für die Apoptose nach proteasomaler Inhibition
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21893
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120717-095352-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pietkiewicz, Sabine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,95 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.07.2012 / geändert 15.07.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Jänicke, Reiner [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Proteasomale Inhibitoren besitzen ein besonderes zytotoxisches Profil, da sie in hohem Maße Apoptose in entarteten Krebs-, jedoch nicht in gesunden Gewebezellen induzieren. Somit stellen sie ein vielversprechendes Mittel für die Krebstherapie dar. In der Tat wurde mit Bortezomib (VelcadeTM) im Jahr 2003 der erste proteasomale Inhibitor für die Behandlung von Patienten mit einer Erkrankung am Mantelzelllymphom oder Multiplen Myelom zugelassen. An der Induktion von Apoptose bei proteasomaler Inhibition sind eine Vielzahl von Effektormolekülen und Signalwegen beteiligt, die genauen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch nur unzureichend aufgeklärt. So wurden zwar in einer Vielzahl von Krebszelllinien sowohl die Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinasen (JNK) als auch die Induktion des pro-apoptotischen BH3-only Proteins Noxa als essenzielle Ereignisse der Proteasominhibitor-vermittelten Apoptose identifiziert, eine Verbindung zwischen beiden Signalwegen oder der Einfluss einzelner JNK-Isoformen auf die Noxa-Expression oder Apoptose wurde hierbei allerdings nicht analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand von Untersuchungen in JNK1- und JNK2-defizienten embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) erstmals eine Verbindung beider Signalwege durch eine JNK1-abhängige Expression von Noxa festgestellt, welche für die Induktion von Zelltod durch Inhibitoren des Proteasoms verantwortlich ist. So konnte anhand von Messungen der Zellmembranintegrität, der DNA-Fragmentierung, des mitochondrialen Membranpotenzials sowie der Caspase-3-Aktivierung eine rasche Apoptoseinduktion nach proteasomaler Inhibition nur in JNK1-exprimierenden JNK2-defizienten MEFs beobachtet werden. Dagegen traten diese Apoptosemerkmale in Abwesenheit eines oder beider JNK1-Allele stark verzögert und deutlich verringert auf. In Übereinstimmung hiermit wurde eine massive Induktion von Noxa auf mRNA- und Proteinebene nach proteasomaler Inhibition nur in JNK2-/- MEFs beobachtet, nicht aber in JNK1+/- und JNK1-/- MEFs, in denen Noxa deutlich schwächer bzw. nicht induziert wurde. Da im Rahmen dieser Arbeit in RNA-Interferenzstudien nachgewiesen wurde, dass ein Knockdown von Noxa den Proteasominhibitor-vermittelten Zelltod ausschließlich in JNK2-, nicht aber in JNK1-defizienten MEFs signifikant reduzierte, verdeutlichen diese Daten eine JNK1-abhängige Regulation der zugrunde liegenden Zelltodprozesse. Weitere Untersuchungen demonstrierten die Abhängigkeit der Proteasominhibitor-vermittelten Apoptose von de novo Proteinsynthese, weswegen die Existenz eines Transkriptionsfaktors postuliert wurde, der JNK1-abhängig die Expression von Noxa steuert. Obwohl zahlreiche für diese Aufgabe infrage kommende Transkriptionsfaktoren inklusive p53, c-Jun, c-Myc, ATF3, ATF4 und HIF1 durch proteasomale Inhibition hochreguliert wurden, konnte einzig die siRNA-vermittelte Reduktion des Onkogens c Myc eine Protektion JNK2-defizienter MEFs vor der Proteasominhibitor-induzierten Apoptose bewirken. Zusammen mit den Beobachtungen, dass durch diese Maßnahme JNK1-defiziente Zellen nicht vor später Apoptose geschützt werden konnten und die aktivierende Phosphorylierung von c-Myc nach proteasomaler Inhibition fast ausschließlich in JNK2-/- MEFs stattfand, ließen diese Ergebnisse auf eine mögliche JNK1-c-Myc-Noxa-Achse schließen. Da aber der Knockdown von c-Myc keinen Einfluss auf die Noxa-Expression hatte, zeigen diese Ergebnisse, dass die Apoptoseinduktion nach proteasomaler Inhibition zwar JNK1-abhängig sowohl über c Myc als auch über Noxa vermittelt wird, aber auch, dass beide Signalwege unabhängig voneinander agieren. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals die bedeutende Rolle der JNK-Isoform JNK1 in Apoptose nach proteasomaler Inhibition näher charakterisiert werden. Hierbei zeigte es sich, dass Inhibitoren des Proteasoms zwei separate JNK1-abhängige Signalwege induzieren, welche Apoptose entweder über den Transkriptionsfaktor c-Myc oder über das BH3-only Protein Noxa vermitteln. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, sowohl das Verständnis der Apoptoseinduktion in Krebszellen nach Behandlung mit proteasomalen Inhibitoren als auch die zukünftige Entwicklung darauf basierender Krebstherapien zu verbessern. Inhibitors of the proteasomal system (IPSs) show a unique cytotoxic profile, as they exert potent apoptosis inducing capabilities in tumor cells, but leave normal tissue cells unharmed. Hence, their usage as drugs for cancer therapy is promising. Indeed, in 2003 the first proteasomal inhibitor Bortezomib (VelcadeTM) was approved to treat patients suffering from multiple myeloma or mantle cell lymphoma. Multiple signaling pathways and effector molecules contribute to IPS-induced apoptosis, but the underlying molecular mechanisms are still incompletely deciphered. Activation of the c-Jun N-terminal kinases (JNK) and induction of the pro-apoptotic BH3-only protein Noxa have been identified as essential events in IPS-induced apoptosis of many cancer cell lines. However, the interplay of these two pathways or the contribution of individual JNK isoforms to Noxa expression and apoptosis have not been addressed before. Analyzing JNK1- and JNK2-deficient mouse embryonic fibroblasts (MEFs), it was demonstrated here for the first time, that the two pathways are indeed connected and that JNK1-induced expression of Noxa is required for IPS-induced apoptosis. Only JNK1-expressing JNK2-deficient MEFs showed a rapid IPS-mediated apoptosis induction as demonstrated by measuring cell membrane integrity, DNA fragmentation, loss of mitochondrial membrane potential and caspase-3 activation. In contrast, the appearance of these hallmarks of apoptosis was strongly delayed and reduced in the absence of one or both JNK1 alleles. In accordance with this, a massive induction of Noxa was detected at the mRNA and protein level only in IPS-treated JNK2-/- MEFs, while its expression was strongly reduced or even completely impaired in similar treated JNK1+/- and JNK1-/- MEFs, respectively. Consistently, RNA-interference studies showed that knockdown of Noxa significantly reduced IPS-mediated cell death exclusively in JNK2-, but not in JNK1-deficient MEFs. Together, these data strongly implicate a JNK1-dependent regulation of Noxa that controls the underlying cell death processes. Further studies demonstrated that IPS-induced apoptosis strongly depends on de novo protein synthesis, suggesting the existence of a transcription factor that controls the expression of Noxa in a JNK1-dependent manner. Although several potential transcription factors including p53, c-Jun, c-Myc, ATF3, ATF4 and HIF1 were shown here to be induced by IPSs, only siRNA-mediated repression of c-Myc caused a reduction of IPS-induced apoptosis in JNK2-deficient MEFs. As this knockdown could not protect JNK1-deficient MEFs from the delayed JNK1-independent induction of apoptosis and because activating phosphorylations of c-Myc were almost exclusively observed only in JNK2-/- MEFs, the existence of a JNK1-c-Myc-Noxa axis was postulated. However, as knockdown of c-Myc had no influence on Noxa expression, these results indicate that although IPS-induced apoptosis critically depends on both, c-Myc and Noxa, they most likely function independently of each other despite both being activated in a JNK1-dependent manner. In summary, the present work characterizes for the first time a most eminent role of the JNK-isoform JNK1 in IPS-mediated apoptosis. It was shown that IPS-induced apoptosis critically depends on JNK1 that induces two distinct signaling pathways that either rely on the transcription factor c-Myc or the BH3-only protein Noxa. Thereby, these results greatly contribute to our understanding of IPS-induced apoptosis signaling and may thus help to improve future IPS-based anti-cancer therapies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	17.07.2012
Dateien geändert am:	17.07.2012
Promotionsantrag am:	28.05.0201
Datum der Promotion:	25.06.2012