Dokument: Heterologe Expression, Kristallisation und Untersuchungen zur Struktur
| Titel: | Heterologe Expression, Kristallisation und Untersuchungen zur Struktur | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2038 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20001219-000038-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Eidhoff, Ulf B. [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Büldt, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Hollenberg, Cornelis P. [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Beta-Arrestin, G-Protein gekoppelte Rezeptoren, Apoptose,prostate apoptosis response 4, heterologe Expression,Kristallisation,Proteinstuktur, Inositolhexaphosphat,neurodegenerative Erkrankungenbeta-arrestin, G-protein coupled receptors, apoptosis,prostate apoptosis response 4,heterologous expression,crystallization, proteinstructure, inositolhexaphosphate,neurodegenerative diseases | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | b-Arrestine sind essentielle Regulatoren G-Protein gekoppelter
Rezeptoren. Sie vermitteln sowohl die Signalterminierung als auch in Funktion eines Adaptermoleküles die Internalisierung der Rezeptoren von der Plasmamembran über 'Clathrin coated Pits'. In dieser Arbeit wurden zunächst Protokolle zur heterologen Expression von bovinem b-Arrestin 1 in S. cerevisiae und zur Reinigung des rekombinanten Proteins entwickelt. Durch molekularbiologische Methoden wurden dem b-Arrestin C- und N-terminale Affinitätstags angefügt. Die Reinigung erfolgte durch Affinitätschromatographie und führte zu Ausbeuten von bis zu 2,7 mg b-Arrestin / Gramm Hefezellen. Die Reinheit des Proteins konnte durch Verwendung zweier verschiedener affinitätstags und sequenzielle Reinigung optimiert werden. Durch Mutagenese von vier Cysteinen gegen Serine wurde die Stabilität des gereinigten Proteins gegen Oxidation verbessert. Ferner zeigte sich, daß der Einsatz hoher Konzentrationen an Phosphationen die Stabilität des Proteins in Lösung signifikant erhöht. Die Funktionalität des heterolog exprimierten b-Arrestins wurde anhand von Bindungsstudien mit Rhodopsin bestätigt. Unter Verwendung von K,Na-Tartrat als Fällungsmittel konnte b-Arrestin kristallisiert werden, wobei die geringe Stabilität und die fehlenden Diffraktions- eigenschaften der bis zu 800 µm großen Kristalle zunächst die röntgenkristallographische Analyse behinderte. Durch die Co-Kristallisation von b-Arrestin mit Inositiolhexaphosphat (IP6) als Ligand konnte die Diffraktionsqualität der Kristalle erheblich gesteigert werden. Es zeigte sich, daß weder die Art und Position der Affinitätstags noch IP6 einen Einfluß auf den Habitus der Kristalle respektive die Packung der Moleküle im Kristall hat. Anhand mit Sychrotronstrahlung gemessener Datensätze und der Methode des Molekularen Ersatzes der bekannten Röntgenstruktur von visuellem Arrestin, wird derzeit die Molekülstruktur des b-Arrestin 1 bestimmt. Darüber hinaus wurde b-Arrestin mit Quecksilber durch Co-Kristallisation derivatisiert, wodurch die Strukturdeterminierung, von dem Arrestin-Modell unabhängig, durch die Methode des isomorphen Ersatzes ermöglicht wird. Als erstes Ergebnis der röntgenkristallographischen Analyse konnte eine Bindestelle für IP6 in der C-terminalen Kuppel des b-Arrestinmoleküls identifiziert werden. Weitere, in der Literatur postulierte Bindestellen für IP6 konnten dagegen nicht verifiziert werden. Ziel der weiteren Arbeiten wird die Verbesserung der kristallographischen Auflösung der Kristalle sowie die Co-Kristallisation von b-Arrestin mit seinen Bindungspartnern sein. PAR-4 spielt als protagonistischer Faktor eine entscheidene Rolle bei der Vermittlung des programmierten Zelltodes, sowohl in bestimmten Tumorzellen als auch in der Symptomatik vieler neurodegenerativer Krankheiten, wie Alzheimer oder Parkinson. PAR-4 scheint in dieser apoptotischen Signalkaskade an einem sehr frühen Punkt aktiv zu sein. In den hier vorgestellten Arbeiten wurde versucht, PAR-4 heterolog zu exprimieren und zu kristallisieren. Erste Versuche scheiterten an der geringen Löslichkeit des Proteins, ein Problem, das durch die Verwendung hoher Konzentrationen zweiwertiger Kationen überwunden werden konnte. Durch Verwendung von Affinitätstags und chromatographischer Reinigungsmethoden konnten für die Kristallisation ausreichende Ausbeuten an PAR-4 sowohl aus E.coli (10 mg/g Zellen) als auch aus S.cerevisiae (2 mg/g Zellen) gewonnen werden. Die Funktionalität des Proteins wurde auf physiologischer Ebene durch einen Kinasetest überprüft. Der Faltungszustand bzw. die Struktur des isolierten PAR-4 wurde durch verschiedene biophysikalische Methoden wie NMR und FTIR-Spektroskopie untersucht und vorläufig charakterisiert. Kristallisationsexperimente führten bisher nur zu Kristallen, die nicht für eine röntgenkristallographische Analyse geeignet sind. Die Experimente hierzu stehen allerdings erst am Anfang. Ziel der weiteren Arbeiten wird die Ermittlung der dreidimensionalen Struktur von PAR-4 sein.b-arrestins are essential regulators of G-Protein coupled receptors. In addition to terminating the signal cascade, they mediate the endocytosis of the receptors through 'clathrin coated pits'. In this work the protocols for the heterologous expression and purification of bovine b-arrestin in S.cerevisiae are established. Through mutagenesis affinity tags were added to the b-arrestin gene. Affinity chromatography yielded up to 2.7 mg of protein per gram of cells. The purity of the protein was optimized by usage of two different affinity tags (C- and N- terminus) and sequential purification. The stability against oxidation and the solubility of the protein were significantly increased through the mutagenesis of four cysteine residues to serines and the employment of high concentrations of phosphate. The functionality of the heterologously expressed b-arrestin was demonstrated by means of its capacity to bind rhodopsin Using tartrate as a precipitant, crystals of purified protein were grown as large as 800 µm; however the low stability and poor diffraction hampered crystallographic success. By co-crystallization of b-arrestin with its ligand inositol-hexaphosphate (IP6) the diffraction quality of the crystals was dramatically improved. Neither the type nor the position of the affinity tag used had any significant influence on the appearance of the crystals hence on the packing of the molecules. Crystallographic data sets obtained using synchrotron radiation are currently being analyzed to solve the three-dimensional structure of b-arrestin by molecular replacement of the known structure of visual arrestin. Furthermore co-crystallized heavy metal derivatives of b-arrestin were performed, thereby enabling structure- determination independent of the arrestin-model by means of isomorphous replacement. A first result to emerge from this analysis was the mapping of the IP6-binding site to the C-terminal dome of the b-arrestin molecule as previously proposed. Furthermore there was no evidence in support of additional binding-sites for IP6 as postulated in the literature. Further work will involve the improvement of the diffraction quality of the crystals, the determination of the three-dimensional structure of b-arrestin as well as attempts to co-crystallize b-arrestin together with other proteins which interact specifically with it. PAR-4 plays an essential role mediating the susceptibility of cells towards apoptosis, is active in certain tumors and is a protagonist responsible for some symptoms of various neurodegenerative diseases such as the Alzheimer's or Parkinson's. In the apoptotic signal cascade PAR-4 seems to act at an early stage. With the experiments presented in this thesis attempts were made to heterologously express and to crystallize PAR-4. First trials failed due to the low solubility of the protein, a problem which was overcome with high concentrations of divalent cations. Using affinity tags and chromatographic methods sufficient amount of highly purified protein, suitable for crystallization were obtained from E.coli (10 mg/g cells) as well as from S.cerevisiae (2 mg/g cells). Functionality of the protein on the physiological level was tested with a kinase assay. The structure of the isolated protein and its integrity was investigated and preliminarily described by biophysical techniques such as NMR and FTIR-spectroscopy. Crystallization attempt so far have yielded crystals unsuitable for crystallographic pursuits. These results serve as groundwork towards the three dimensional structure of PAR-4. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 19.12.2000 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.12.2000 | |||||||
| Datum der Promotion: | 19.12.2000 |
