Dokument: Struktur und Regulation der F1FO ATP Synthase aus Spinat Chloroplasten

Titel:	Struktur und Regulation der F1FO ATP Synthase aus Spinat Chloroplasten
Weiterer Titel:	Structure and Regulation of the F1FO ATP Synthase from Spinach Chloroplasts
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=20362
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120131-105135-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Grieben, Mariana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,82 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.01.2012 / geändert 24.01.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	ATP Synthase, Fo, Protonengradient, Proteinkristallisation, Röntgenstrukturanalyse, Membranprotein, Spinat, Chloroplast
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die chloroplastidäre CF1CFO ATP Synthase aus Spinacia oleracea gehört dem F-Typ der ATPasen an und katalysiert die Synthese von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat, angetrieben von einem transmembranen elektrochemischen Protonengradienten. Das Enzym besteht aus den Untereinheiten α3β3γδεc14abb‘ und lässt sich in zwei Subkomplexe einteilen: den wasserlöslichen CF1 und den membranlokalisierten CFO. Während im CF1 ATP synthetisiert wird, werden an der a/c Kontaktfläche des CFO Protonen entlang des herrschenden Gradienten transportiert. Der genaue Mechanismus der Protonentranslokation ist noch unbekannt. Die bei der Protonentranslokation gewonnene Energie führt zur Rotation des c14γε Komplexes, wobei der periphere Stator abb‘δ verhindert, dass das (αβ)3 Hexamer der Bewegung folgt. Die γ Untereinheit interagiert unterschiedlich mit den drei katalytisch aktiven β Untereinheiten, was zu einer Asymmetrie dieser führt. Die drei β Untereinheiten verhalten sich kooperativ zueinander und befinden sich jederzeit in unterschiedlichen Stadien der Katalyse. Die Hydrolyse von ATP wird in Chloroplasten durch eine Regulation durch die Oxidoreduktase Thioredoxin verhindert. Wenn der transmembrane Protonengradient, der während der Photosynthese entsteht, im Dunkeln zusammenbricht, oxidiert Thioredoxin zwei Cysteinreste in der CF1-γ Untereinheit, wodurch das Enzym inaktiviert wird. Dieser Prozess ist reversibel. Die ATP Synthase aus dem thermophilen Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus ähnelt in ihrem Aufbau der ATP Synthase aus Chloroplasten, mit dem Unterschied, dass, obwohl auch Cyanobakterien Photosynthese betreiben, eine Regulation der F1-γ Untereinheit über Thioredoxin nicht stattfindet. Mit der nativ gereinigten chloroplastidären CF1CFO ATP Synthase aus Spinacia oleracea wurden Kristallisationsversuche unternommen. Es wurden Versuche unternommen die Qualität der c14-Rotorring Kristalle (Vollmar et al, 2009) zu verbessern und die intakte ATP Synthase mit allen Untereinheiten zu kristallisieren, welche zum Wachstum von Kristallen eines γεcxa Komplexes führten, die bis 2 Å streuten. Mit der Absicht die Regulation und die damit verbundenen Konformationsänderungen der chloroplastidären CF1-γ Untereinheit zu verstehen, wurde ein CF1γ-ThioredoxinE. coli Fusionsprotein heterolog im Expressionswirt E. coli exprimiert und aus dem bakteriellen Expressionssystem gereinigt. Kristallisationsansätze wurden sowohl mit dem oxidierten, als auch mit dem reduzierten Zustand durchgeführt. Vom oxidierten Zustand sind Kristalle gewachsen, die jedoch keine Beugung von Röntgenstrahlung zeigten. Der reduzierte Zustand hingegen konnte aufgrund der Instabilität des monomeren Fusionsproteins nicht kristallisiert werden. Die F1 ATP Synthase aus dem thermophilen Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus wird zwar nicht über Thioredoxin reguliert, jedoch kann man ihr eine Redoxsensitivität durch Insertion der regulatorischen Aminosäuresequenz aus Chloroplasten in die F1-γ Untereinheit verleihen. Kristallisationsansätze wurden mit der oxidierten und mit der reduzierten chimären F1 ATP Synthase (α3β3γredoxε) durchgeführt und parallel auch mit dem Wildtyp F1 (α3β3γ). Alle drei Zustände konnten unter gleichen Bedingungen kristallisiert werden, jedoch eigneten sich die Proteinkristalle aufgrund ihrer Morphologie nicht für Röntgenbeugungsexperimente. The CF1CFO ATP synthase from Spinacia oleracea belongs to the F-Type ATPases and catalyses the formation of ATP from ADP and inorganic phosphate powered by a transmembrane proton electrochemical gradient. The enzyme is composed by the subunits α3β3γδεc14abb‘ and can be divided into two subcomplexes: the soluble CF1 and the membrane-embedded CFO. The CF1 subcomplex synthesises ATP whereas protons are translocated at the c/a interface of the CFO in the direction of the gradient. The exact mechanism of the proton translocation is still to be clarified. The energy gained from the translocation of protons leads to the rotation of the c14γε complex while the peripheral stator abb'δ prevents the (αβ)3 hexamer from following the movement. The γ subunit interacts differently with the three catalytic active β subunits endowing them with different nucleotide affinities. The three β subunits behave cooperative to each other and are at any time in different stages of catalysis. The hydrolysis of ATP is prevented in chloroplasts by the regulation of the CF1-γ subunit. When the transmembrane proton gradient, created during photosynthesis, collapses in the dark, thioredoxin, an oxidoreductase, inactivates the enzyme by oxidizing two cysteins located in the CF1-γ subunit. This inactivation can be reversed. The ATP synthase from the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus is similar to the ATPase from chloroplasts. Both organisms carry out photosynthesis. The major difference is probably the fact that there is no regulation of the CF1-γ subunit by thioredoxin in T. elongatus. Crystallization trials were done with the CF1CFO ATP synthase purified from Spinacia oleracea. Attempts were made to improve the diffraction quality of the c14-rotor ring crystals (Vollmar et al, 2009) and to crystallize the intact ATP synthase containing all subunits. These efforts gave rise to a γεcxa complex that diffracted to 2 Å. To study the redox regulation of the chloroplastic CF1-γ subunit and the conformational changes involved in this regulation a CF1γ-thioredoxinE. coli fusion protein was heterologously overexpressed in E. coli and purified. Crystallization trials were made with the oxidized and the reduced state. Crystals of the oxidized state were obtained, which however did not diffract roentgen radiation. The reduced state could not be crystallized due to the instability of the monomeric fusion protein. The F1 ATP synthase from the cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus is not controlled by thioredoxin but it is possible to lend a redox sensitivity to the thermophillic F1-γ by insertion of the regulatory amino acid sequence from the chloroplast γ subunit. Crystallization trials were made with the oxidized and the reduced chimeric F1 ATP synthase (F1α3β3γredoxε). Additionally the same crystallization trials were made with the wild type F1 (α3β3γ). All three protein complexes could be crystallized with the same crystallization condition but the crystal morphology was inappropriate for X-ray experiments.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	31.01.2012
Dateien geändert am:	31.01.2012
Promotionsantrag am:	30.11.2011
Datum der Promotion:	17.01.2012