Dokument: Analyses on the Formation of Regulatory Systems for Expression and Maturation of Photosynthetic Complexes in Arabidopsis thaliana

Titel:	Analyses on the Formation of Regulatory Systems for Expression and Maturation of Photosynthetic Complexes in Arabidopsis thaliana
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18658
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110712-111727-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lyska, Dagmar Anna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 17,48 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.07.2011 / geändert 12.07.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Jahns, Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chloroplast biogenesis is controlled by nuclear-encoded factors that are synthesized in the cytosol and subsequently imported into the plastid. In higher plants and green algae, a large number of auxiliary proteins regulating the expression (transcription, RNA-processing, -editing, -stability, translation), maturation and assembly of the photosynthetic complexes have been identified. Since many of these factors act in concert with other proteins and/ or as part of protein complexes, analyses of interactions and complex formation can help shading light on their precise function. In the present PhD thesis a set of plant binary vectors for differential tagging of proteins in Arabidopsis thaliana was developed. Diverse mono-, di- and triple-tags enable detection and flexible purification of proteins and their interaction partners. To prevent overexpression of tagged proteins, which is disadvantageous for co-purification of interaction partners, promoter sequences from three chloroplast biogenesis factors (HCF107, HCF136 and HCF173) were chosen to drive expression. Promoters were analyzed histochemically and quantatively by β-glucoronidase (GUS) fusions. Different promoter/ tag combinations were tested for their influence on protein function using the chloroplast biogenesis factors HCF208 and HCF107. Single-step and tandem affinity purification of HCF208 via different tags confirmed the integrity of the cloned tags In the second part of this thesis, the factor HCF208 from Arabidopsis was identified by screening of a mutant collection carrying ethylmethane sulfunate (EMS)-induced point mutations for lines affected in photosynthetic electron transport. By spectroscopic measurements and immunological analyses the hcf208 mutant was shown to be deficient in biogenesis of the cytochrome b6f complex, primarily by absence of the covalent heme cn of cytochrome b6. HCF208 was found to encode for the Arabidopsis homolog of Chlamydomonas reinhardtii CCB2, which acts in concert at least three other proteins (CCB1, CCB3 and CCB4) displaying a new pathway of heme attachment to cytochrome b6, referred to as “system IV”. As analyzed in this study Arabidopsis T-DNA mutants affected in loci encoding for the AtCCB1, AtCCB2 and AtCCB4 proteins and the hcf208 mutant exhibited similar phenotypes. HCF208 was shown to be an integral membrane protein. Interaction analyses using two-dimensional Blue Native-PAGE, yeast split ubiquitin assays and affinity purification of tagged HCF208 indicated a stable dimerization between HCF208 and AtCCB4, and a transient HCF208-AtCCB3 interaction. The protein encoded by the hcf208 mutant allele, which carries a point mutation in the first of two transmembrane domains, was affected in the AtCCB3- but not AtCCB4-interaction indicating distinct interaction sites. The second chloroplast biogenesis factor examined in this PhD thesis is HCF107 that is required for expression of the PSII subunit PsbH. The function of HCF107 was supposed to be processing and/ or stabilization of psbH transcripts and their translation. In the present study, the HCF107 protein was found to form large membrane-associated complexes, which contain RNA and presumably also ribosomes, pointing to a function of HCF107 in translation. Formation of HCF107 complexes and the localization of HCF107 inside the chloroplast were found to vary in light and in darkness pointing to a light-dependent regulation of PsbH synthesis. A model of HCF107 in light-dependent psbH transcript stabilization, recruitment to chloroplast membranes and co-translational membrane insertion of PsbH was provided. Die Biogenese von Chloroplasten wird durch nuclear-kodierte Faktoren kontrolliert, die im Zytosol synthetisiert und anschliessend in die Plastide importiert werden. In höheren Pflanzen und Grünalgen wurde eine grosse Anzahl von Hilfsfaktoren identifiziert, welche die Expression (Transkription, RNA-Prozessierung, -Edierung, -Stabilität, Translation), Reifung und Assemblierung der photosynthetischen Komplexe regulieren. Da viele dieser Faktoren in Verbindung mit anderen Proteinen und/ oder als Teil eines Proteinkomplexes wirken, kann durch Untersuchungen von Interaktionen und Komplexformation die genaue Funktion dieser Proteine aufgedeckt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Set von binären Vektoren für differentielle Etikettierung von Proteinen in Arabidopsis thaliana entwickelt. Verschiedene Mono-, Di- und Triple-Proteinetikette erlauben die Detektion und die flexible Aufreinigung von Proteinen und ihrer Interaktionspartner. Um Überexpression von etikettierten Proteinen zu vermeiden, was sich negativ auf die Aufreinigung von interagierenden Proteinen auswirken würde, wurden Promotorsequenzen von drei Chloroplasten-Biogenesefaktoren (HCF107, HCF136 und HCF173) auserwählt die Expression zu steuern. Die Promotoren wurden histochemisch und quantitativ durch β-Glucoronidase (GUS)-Fusionen analysiert. Verschiedene Promotor/ Etikett-Kombinationen wurden auf ihren Einfluss auf die Funktion der Chloroplasten-Biogenesefaktoren HCF208 und HCF107 getestet. Affinitätsaufreinigungen von HCF208 über einen und mehrere Aufreinigungsschritte unter Anwendung verschiedener Etikette bestätigten die Integrität der klonierten Etikette. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch die Untersuchung einer EMS (Ethylmethan-sulfonat)-induzierten Arabidopsis-Mutantenkollektion, die im photosynthetischen Elektronen-transport gestört ist, der Faktor HCF208 identifiziert. Spektroskopische Messungen und immunologische Analysen der hcf208-Mutante deckten einen Defekt in der Biogenese des Cytochrom b6f-Komplexes auf, welcher aus dem Fehlen des kovalent gebundenen Häms cn an Cytochrom b6 resultierte. HCF208 kodiert für das Arabidopsis-Homolog des CCB2-Proteins aus Chlamydomonas reinhardtii, welches in Verbindung mit mindestens drei anderen Proteinen (CCB1, CCB3 und CCB4) einen neuen Häm-Assemblierungsweg für Cytochrom b6 bildet, welcher als „System IV“ bezeichnet wird. In der vorliegenden Arbeit analysierte T-DNA-Insertionsmutanten aus Arabidopsis, welche in den AtCCB1, AtCCB2 und AtCCB4 Loci betroffen sind, und die hcf208-Mutante wiesen vergleichbare Phänotypen auf. HCF208 wurde als integrals Membranprotein identifiziert. Interaktionsanalysen unter zu Hilfenahme von zweidimensionaler “Blue Native”-Gelelektrophorese, Hefe Split Ubiquitin Analysen und Affinitätsaufreinigungen des etikettiertem HCF208-Proteins, wiesen auf ein stabiles HCF208-AtCCB4-Dimer hin, welches über HCF208 transient mit AtCCB3 interagiert. Das durch das hcf208-Mutantenallel kodierte Protein, welches eine Punktmutation in der ersten von zwei Transmembrandomänen aufweist, war in seiner Interaktion mit AtCCB3, aber nicht AtCCB4, eingeschränkt, was auf unterschiedliche Interaktionsdomänen hinwies. Der zweite im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Chloroplasten-Biogenesefaktor ist das Protein HCF107, welches für die Expression der PSII-Untereinheit PsbH benötigt wird. HCF107 wurde eine Funktion in der Prozessierung und/ oder Stabilisierung des psbH-Transkripts und seiner Translation zugesprochen. In der vorliegenden Arbeit wurde HCF107 durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationen als Teil eines hochmolekularen, membranassoziierten Komplexes identifiziert, welcher RNA und wahrscheinlich auch Ribosomen enhielt, was auf eine Funktion von HCF107 in der Translation hinwies. Ferner wurde herausgefunden, dass die Bildung von HCF107-Komplexen und die Lokalisierung des Proteins im Chloroplasten sich in Licht und in Dunkelheit unterscheiden, was auf eine lichtabhängige Regulation der PsbH-Synthese hinwies. Ein Modell für die lichtabhängige psbH-Transkript-Stabilisierung und -Rekrutierung an Chloroplastenmembranen und die kotranslationale Membraninsertion von PsbH wurde aufgestellt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Entwicklungs- und Molekularbiologie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	12.07.2011
Dateien geändert am:	12.07.2011
Promotionsantrag am:	05.05.2011
Datum der Promotion:	01.07.2011