Dokument: Novel phospholipases A of Pseudomonas aeruginosa: biochemical characterisation and cellular localisation

Titel:	Novel phospholipases A of Pseudomonas aeruginosa: biochemical characterisation and cellular localisation
Weiterer Titel:	Neue Phospholipasen A aus Pseudomonas aeruginosa: biochemische Charakterisierung und zelluläre Lokalisierung
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18456
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110617-105823-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Kovacic, Filip [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,34 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.06.2011 / geändert 16.06.2011
Stichwörter:	Phospholipases, Pseudomonas aeruginosa, virulence, X-ray structure, cellular localisation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Phospholipases A (PLA) represent a group of bacterial virulence factors with the ability to interact with host membranes and lipid signalling. Although some bacterial PLA are proven to be virulence factors, the number of known PLAs is still limited. Furthermore the details about host-pathogen interaction mechanisms remain to be elucidated. Since none PLA has been described in P. aeruginosa PA01 so far we wanted to examine the phospholipolytic (PLA) potential of this pathogen bacterium. For that reason we launched a comprehensive study to identify genes which might encode proteins displaying PLA activity. We have successfully demonstrated periplasmic and membrane associated PLA activity in P. aeruginosa PA01. In silico analyses of the P. aeruginosa PA01 genome revealed ten promising genes, named phospho-lipolytic genes, which were experimentally analysed in more details. A systematic approach encompassing sequence analysis, amplification, cloning, expression and purification of phospho-lipolytic enzymes disclosed interesting enzymatic activities for six previously uncharacterised enzymes. Thus, two novel lipases were detected; LipF, a probably membrane bound lipase and PlpD, a patatin-like lipase, described as the fist example of a novel subgroup of the autotransporter protein family. TesA was characterised as the first lysophospholipase A of P. aeruginosa PA01 in this work. Additional three enzymes PlaK, PlaB and PlbF were demonstrated to possess PLA activity. The most promising candidates among the identified phospho-lipolytic enzymes were chosen to be studied in more details, namely: PlaK, TesA and PlbF. PlaK was predicted to be a putative esterase with a conserved beta-lactamase active site motif. Thus, it belongs to family VIII of lipolytic enzymes. Despite the conservation of β-lactamase active site motif, esterases belonging to family VIII commonly exert solely esterase activity. Few of these esterases (family VIII) are described to date and only one them exhibits faint β-lactamase activity. Hence, purified PlaK was inspected for esterase, beta-lactamase and PLA2 activities. Notable esterase (176 U/µl) activity of PlaK was demonstrated but also considerable β-lactamase (44 U/µl) and low PLA2 (9 U/µl) activity. Therefore, we concluded that PlaK is a unique multifunctional enzyme among bacterial hydrolases because to date an enzyme has not been described that possesses esterase, PLA2 and β-lactamase activities concomitantly. The physiological relevance of such substrate promiscuity of PlaK is still unknown. However, the combination of those enzyme activities is tempting to attribute the function of PlaK to the intrinsic resistance of P. aeruginosa towards β-lactam antibiotics. TesA is a putative thioesterase of P. aeruginosa PA01 which function was predicted because of its high sequence homology to an E. coli thioesterase. Both belong to the GDSL-hydrolase family characterised by a protein fold distinct from common α/β-hydrolase fold. E. coli thioesterase is structurally well characterised and a multifunctional enzyme with additional esterase, lysophospholipase and protease activities. Therefore, we have examined respective enzymatic functions and structural features of TesA from P. aeruginosa PA01. TesA was purified and shown to have pronounced esterase and lysophospholipase A1 activities. Despite the predicted function of TesA we could not detect any thioesterase activity, neither short nor long chain acyl-CoA esters were accepted as substrates. Consequently, TesA of P. aeruginosa is not a thioesterase and in addition its protease activity could not be detected. Despite the pronounced sequence homology of E. coli thioesterase and P. aeruginosa TesA we demonstrated a striking contrast in the enzymatic functions. In order to explain these differences, TesA was crystallised and its crystal structure was solved in the course of this work. The α/β/α-fold, catalytic triad and the oxyanion hole of TesA are similar to TAP and to other GDSL-hydrolases. However, comparison of molecular surface of TesA and TAP revealed remarkable differences in size and polarity of the active site cleft and particularly acyl-CoA binding site. Thereby, we have suggested a possible structural explanation of the missing thioesterase activity of TesA. The physiological function of the periplasmic localised TesA in P. aeruginosa PA01 remains to be elucidated but it may be involved in the detoxification of xenobiotics or lysophospholipids. PlbF displays sequence homology to prokaryotic and eukaryotic phospholipases A, lipases and esterases involved in lipid metabolism and lipid signalling. Indeed, we were able to demonstrate esterase, phospholipase B and thioesterase activities of PlbF. Subcellular localisation experiments revealed its association with the membrane fraction of P. aeruginosa. Further localisation studies suggested that PlbF is anchored into the inner membrane as an integral protein. These data are in agreement with in silico analyses which have predicted two hydrophobic transmembrane helices in the N-terminal sequence of PlbF. Additionally, we recognised a signature of integral membrane proteins in the first helix of PlbF. This motif is a helix-helix interaction site of inner membrane proteins suggesting a dimerisation of PlbF. These findings were supported by observed dimerization of PlbF in P. aeruginosa PA01 membranes upon treatment with denaturants. PlbF is active as monomer but the detailed biological function of putative dimerisation cannot be completely explained at the moment. However, PlbF may be involved in signalling processes through monomerization/dimerization process and the resulting conformational changes upon the external factors. To investigate the correlation of PlbF and P. aeruginosa PA01 virulence, a plbF negative strain of P. aeruginosa was constructed and compared to wild type P. aeruginosa PA01 in D. melanogaster virulence model. Significant attenuation of the plbF negative mutant strain in killing of flies was observed. This result confirmed that PlbF is a novel virulence factor of P. aeruginosa PA01. Furthermore it is the first phospholipase A2 described to contribute to the virulence of P. aeruginosa PA01. Herein present comprehensive set of data is the first report about phospholipases A of P. aeruginosa PA01 which may represent a novel group of virulence factors. However, this knowledge is a starting point for continuative research of role of phospholipases A in virulence of P. aeruginosa PA01. Phospholipasen A (PLA) repräsentieren eine Gruppe bakterieller Virulenzfaktoren, die mit den Membranen der Wirtsorganismen interagieren und eine Rolle beim Lipid Signalling spielen. Obwohl einige bakterielle PLA bereit als Virulenzfaktoren identifiziert wurden, ist die Anzahl bekannter PLA noch limitiert. Darüber hinaus müssen die Mechanismen, die bei der Interaktion zwischen dem pathogenen Organismus und dem Wirt beteiligt sind, noch genauer untersucht werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte das pathogene Bakterium Pseudomonas aeruginosa auf Enzyme mit PLA-Aktivität hin untersucht werden, da bisher noch keine PLA in P. aeruginosa PAO1 beschrieben wurden. Hierzu wurde zunächst eine umfassende bioinformatische Studie durchgeführt, in der Gene identifiziert wurden, die eine PLA-Aktivität ausüben könnten. Parallel wurde experimentell gezeigt, dass in P. aeruginosa periplasmatische und Membran-assoziierte Proteine existieren, die eine PLA-Aktivität aufweisen. Detailliertere in silico Analysen des Genoms von P. aeruginosa PAO1 identifizierten 10 Gene, die als phopho-lipolytische Gene bezeichnet und experimentell genauer untersucht wurden. Im Folgenden wurden diese Gene mittels Amplifizierung, Klonierung, Expression und Reinigung untersucht. Bei den resultierenden phospholiplytischen Enzymen konnten hier erstmals sechs bisher uncharakterisierte Enzyme mit interessanten enzymatischen Aktivitäten beschrieben werden. Es wurden zwei neue Lipasen nachgewiesen; Zum einen LipF, eine vermutlich Membran-gebundene Lipase und zum anderen PlpD, eine Patatin-ähnliche Lipase, die als erstes Beispiel für eine neue Untergruppe der Proteinfamilie der Autotransporter beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde mit TesA die erste Lysophospholipase A von P. aeruginosa charakterisiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass die drei Enzyme PlaK, PlaB und PlbF PLA-Aktivität aufweisen. Die vielversprechendsten Kandidaten unter den identifizierten phospho-lipolytischen Enzymen wurden näher untersucht, als da wären: PlaK, TesA und PlbF. PlaK wurde als putative Esterase mit einem konservierten ß-Lactamase-Sequenzmotiv im aktiven Zentrum hervorgesagt und gehört zur Familie VIII der lipolytischen Enzyme. Trotz des konservierten ß-Lactamase-Sequenzmotivs im aktiven Zentrum besitzen diese Proteine nahezu ausschließlich Esterase-Aktivität. Bis zu diesem Zeitpunkt wurden überhaupt nur wenige Esterasen der Familie VIII beschrieben und nur eine von ihnen wies geringfügige ß-Lactamase-Aktivität auf. Infolgedessen wurde PlaK auf die entsprechenden Enzymaktivitäten hin untersucht. Tatsächlich konnte demonstriert werden, dass PlaK eine beachtenswerte Esterase- (176 U/µl), aber auch eine deutliche ß-Lactamase- (44 U/µl) und eine nur geringe PLA2-Aktivität (9 U/µl) aufweist. Demzufolge ist PlaK das erste multifunktionelle Enzym unter den bakteriellen Hydrolasen, das sowohl PLA2- als auch ß-Lactamase-Aktivität besitzt. Die physiologische Bedeutung dieser Multifunktionalität von PlaK ist noch unbekannt. Dennoch lässt die Kombination solcher Enzymaktivitäten darauf schließen, dass PlaK bei der intrinsischen Resistenz von P. aeruginosa gegenüber ß-Lactam-Antibiotika eine Rolle spielt könnte. TesA aus P. aeruginosa wurde aufgrund hoher Sequenzhomologien zu einer Thioesterase aus E. coli (TAP) als putative Thioesterase vorhergesagt. Beide Enzyme gehören zur Familie der GDSL-Hydrolasen, die sich hinsichtlich ihrer Proteinfaltung deutlich von den üblichen α/ß-Hydrolasen unterscheiden. Die Thioesterase aus E. coli ist strukturell gut untersucht und weist zusätzlich Esterase- Lysophospholipase und Protease-Aktivitäten auf. Daher wurden die entsprechenden enzymatischen Funktionen und strukturellen Merkmale von TesA aus P. aeruginosa untersucht. TesA wurde gereinigt und ausgeprägte Esterase- und Lysophospholipase A1-Aktivität konnte detektiert werden, jedoch keinerlei Protease- oder Thioesterase-Aktivität. TesA akzeptierte weder Kurz- noch Langkettige Acyl-CoA-Ester als Substrate und ist folglich keine Thioesterase. Trotz der vorhergesagten Sequenzhomologien zwischen der Thioesterase aus E. coli und TesA aus P. aeruginosa, wurden beachtliche Unterschiede in den enzymatischen Funktionen aufgedeckt. Um diese Unterschiede besser verstehen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit TesA kristallisiert und anschließend die Kristallstruktur des Enzyms aufgelöst. TesA ähnelt bezüglich der α/β/α-Faltung, der katalytische Triade und der Oxyanion-Höhle dem Enzym TAP und anderen GDSL-Hydrolasen. Vergleiche der molekularen Oberfläche von TesA und TAP deckten jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Größe und Polarität der Spalte des aktiven Zentrums insbesondere der möglichen Acyl-CoA-Bindestelle auf. Diese Unterschiede bieten eine strukturelle Erklärung für die fehlende Thioesterase-Aktivität von TesA. Die physiologische Funktion des im periplasmatischen TesA von P. aeruginosa muß noch aufgeklärt werden. Man kann jedoch spekulieren, dass TesA an der Entgiftung von Xenobiotika oder Lysophospholipiden in P. aeruginosa beteiligt ist. PlbF weist Sequenzhomologien zu prokaryotischen und eukaryotischen Phospholipasen A, Lipasen und Esterasen auf, die am Lipid-Metabolismus aber auch dem Lipid Signaling beteiligt sind. In dieser Arbeit konnte jedoch erstmalig gezeigt werden, dass PlbF Esterase-, Phospholipase B- und Thioesterase-Aktivität besitzt. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von PlbF ergaben, dass PlbF als integrales Membranprotein in der inneren Membran verankert vorliegt. Diese experimentellen Befunde stimmen mit in silico-Analysen überein, die PlbF als Protein mit zwei hydrophoben, transmembranen Helices in der N-terminalen Sequenz von PlbF hervorgesagt haben. Zusätzlich wurde ein Motiv einer Helix-Helix-Interaktionsstelle innerer Membranproteine, die auf eine Dimerisierung von PlbF hinweist gefunden. Die Dimerisierung von PlbF wurde experimentell bestätigt und erfolgte bei Behandlung mit Denaturierungsmitteln. PlbF ist als Monomer aktiv und die biologische Funktion einer möglichen Dimerisierung kann zur Zeit nicht vollständig erklärt werden. Man kann jedoch vermuten, dass PlbF durch Monomerisierung/Dimerisierung und die dadurch resultierenden Konformationsänderungen, die durch externe Faktoren verursacht werden, an Signalübertragungen beteiligt sein kann. Ein PlbF-negativer P. aeruginosa Stamm wurde konstruiert und im Vergleich zu P. aeruginosa PAO1 (Wildtyp) im Virulenz-Modell D. melanogaster untersucht. Bei der PlbF-negativen Mutante von P. aeruginosa wurde eine verminderte Virulenz gegenüber D. melanogaster beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt dass es sich bei PlbF um einen Virulenzfaktor handelt und damit ist es die erste beschriebene Phospholipase A2, die zur Virulenz von P. aeruginosa beiträgt. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die umfassenden Ergebnisse, die in dieser Arbeit gezeigt wurden, darstellen dass die erstmalig beschriebenen Phospholipasen A in P. aeruginosa neue Virulenzfaktoren von P. aeruginosa repräsentieren könnten. Dieses Wissen soll als Anfangspunkt für weiterführende Studien über die Rolle von Phospholipasen A bei der Virulenz von P. aeruginosa dienen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	17.06.2011
Dateien geändert am:	17.06.2011
Promotionsantrag am:	18.05.2010
Datum der Promotion:	23.06.2010