Dokument: Optimierung heterologer Proteinsekretion in Bacillus unter Verwendung wirtsfremder und künstlicher Signalpeptide

Titel:	Optimierung heterologer Proteinsekretion in Bacillus unter Verwendung wirtsfremder und künstlicher Signalpeptide
Weiterer Titel:	Optimization of heterologous protein secretion in Bacillus with non-homologous and artificial signal peptides
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18434
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110614-092818-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Degering, Christian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.06.2011 / geändert 10.06.2011
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Gram-positive Bakterien der Gattung Bacillus werden im großen Maßstab für die industrielle Produktion von Proteinen eingesetzt, da sie in der Lage sind, große Mengen des Zielproteins in den Kulturüberstand zu sekretieren. Neben dem Vorteil, dass ein Zellaufschluss zur Gewinnung des Proteins dadurch überflüssig wird, haben auch die seit Jahrzehnten optimierten, kostengünstigen Fermentationsprozesse dazu beigetragen, dass vor allem B. subtilis und B. licheniformis bevorzugt für die industrielle Proteinproduktion eingesetzt werden. Allerdings gibt es weiterhin zahlreiche Engpässe im Sekretionsablauf, so dass vor allem bei der extrazellulären Produktion von heterologen Proteinen mit Bacillus-Wirten oft nur geringe Ausbeuten erzielt werden können. Ein entscheidendes Kriterium für die Optimierung der Prozessausbeuten ist die Auswahl eines für die Sekretion des Zielproteins effizienten Signalpeptids. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten bereits zu diesem Zweck beschriebene Methoden für die Durchmusterung von Signalpeptid-Banken weiterentwickelt und außerdem erstmals die Exporteffizienzen unterschiedlicher Signalpeptide in verschiedenen anwendungstechnisch interessanten Bacillus-Wirten miteinander verglichen werden. Anhand der Genomsequenzen von B. subtilis und B. licheniformis wurden Homologie-Untersuchungen mit den an der Sekretion beteiligten Komponenten durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass die Translokationsmaschinerie von beiden Organismen sehr ähnlich ist, soweit dies auf Basis der Sequenzähnlichkeiten vorhersagbar war. Allerdings konnte ebenso gezeigt werden, dass es auch signifikante Unterschiede zu geben scheint, wie vor allem am Beispiel der an der Prozessierung der Signalpeptide beteiligten Signalpeptidasen deutlich wurde. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich die Methode des Signalpeptid-Screenings auch in industriell relevanten Bakterienstämmen, die bereits auf eine maximale Sekretion optimiert wurden, anwenden lässt. Dafür wurde eine Signalpeptid-Bank aus B. subtilis für die Optimierung des Exports von zwei heterologen Proteasen in einem anwendungstechnisch interessanten B. licheniformis-Wirt eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Proteinausbeuten im Kulturüberstand um das Dreifache im Vergleich zu einem, für die Sekretion der Proteasen etablierten, Signalpeptid steigern ließen. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde außerdem erstmals nachgewiesen, dass die Durchmusterung von wirtsfremden Signalpeptiden einen vielversprechenden Ansatz für die Optimierung des Proteinexports darstellt. Für die Erhöhung der Diversität der verfügbaren Signalpeptide wurde daher in der vorliegenden Arbeit eine Signalpeptid-Bank mit 220 Sec-Signalpeptiden aus B. licheniformis konstruiert, um erstmals im Screening den direkten Vergleich der Effizienz von wirtseigenen und wirtsfremden Signalpeptiden zu ermöglichen. Dafür wurde das Modell-Protein Subtilisin BPN‘ aus B. amyloliquefaciens ausgewählt und für die Sekretionsoptimierung im Wirt B. subtilis sowohl alle Signalpeptide aus B. subtilis, als auch 220 wirtsfremde Signalpeptide aus B. licheniformis durchmustert. Die höchsten Exporteffizienzen für Subtilisin BPN‘ wurden dabei unter anderem mit wirtsfremden Signalpeptiden erreicht. Die im Hochdurchsatz-Screening ermittelten Steigerungen der Exportleistungen konnten außerdem beispielhaft auf anwendungstechnisch interessante Hochzelldichte-Fermentationen von B. subtilis übertragen werden. Um zu untersuchen, inwieweit sich die in B. subtilis ermittelten Exportleistungen der verschiedenen Signalpeptide auf andere Bacillus-Wirte übertragen lassen, wurden die Exporteffizienzen unterschiedlicher Konstrukte in mehreren Bacillus-Wirten untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen Signalpeptid und Zielprotein in den meisten Fällen einen höheren Einfluss auf die Exporteffizienz zu haben schien, als die Interaktion zwischen Signalpeptid und Translokationsmaschinerie des jeweiligen Wirts. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem erstmals gezeigt, dass sich durch die Durchmischung der funktionalen Domänen von unterschiedlichen Signalpeptiden funktionstüchtige Signalpeptid-Varianten konstruieren lassen. Auf der Grundlage dieser Erkenntnis wurde eine neue Methode entwickelt, mit der sich die Exportleistungen der im Signalpeptid-Screening identifizierten Signalpeptide durch die Konstruktion von künstlichen Signalpeptid-Varianten noch weiter steigern ließen. Gram-positive bacteria of the species Bacillus are frequently used for the industrial production of proteins, because of their ability to secrete large amounts of target protein into the culture supernatant. Beside the advantage that the laborious lysis of the cells for the purification of the target protein gets dispensable in that way, the cheap and effective methods for fermentation processes have contributed to the fact that, in particular B. subtilis and B. licheniformis have become preferred hosts for the industrial production of proteins for many decades. Nevertheless there are still several bottlenecks especially with regard to the extracellular production of heterologous proteins, that often lead to decreased yields in Bacillus hosts. A critical aspect for the optimization of the process yields is the choice of an efficient signal peptide. The aim of the present study was to optimize existing signal peptide screening methods and to investigate the export efficiencies of different signal peptides in distinct Bacillus hosts. By analysis of the sequence homologies of B. subtilis and B. licheniformis, it was predicted that both organisms have quite similar translocation machineries. Nevertheless there were also significant differences, especially concerning the signal peptidases. In the current study it was investigated if the method of screening a set of signal peptides is also applicable to industrially relevant strains, which have been optimized for high level secretion already. For that purpose a collection of B. subtilis signal peptides was used for the secretion optimization of two heterologous proteases in an industrial relevant B. licheniformis expression host. It could be demonstrated that the most efficient signal peptide, originating from B. subtilis, increased the export efficiency about threefold in the B. licheniformis host. Therefore the screening of heterologous signal peptides was proven to be a promising strategy for optimization of protein export. In the current study a set of 220 signal peptides originating from B. licheniformis were amplified to increase the diversity of available signal peptide collections for a distinct host and to allow the simultaneous comparison of the efficiencies of homologous and heterologous signal peptides for the first time in a large-scale setting. The protease Subtilisin BPN’ from B. amyloliquefaciens was chosen as a model protein and all signal peptides from B. subtilis as well as 220 heterologous signal peptides originating from B. licheniformis were used for the secretion optimization in the B. subtilis host. Interestingly, some of the most efficient constructs contained heterologous signal peptides. The export efficiencies detected in the high throughput screening could be verified exemplarily in industrially relevant high cell density cultivations of B. subtilis. To investigate the possibility of transferring the export efficiencies detected for different signal peptides in B. subtilis to other Bacillus hosts, the export capacity of various fusions was compared in different Bacillus hosts. It could be shown that the interaction between the signal peptide and the target protein seemed to have a stronger effect on the secretion efficiency in most cases than the interaction between the signal peptide and the translocation machinery of the particular expression host. Furthermore, the present study showed for the first time that it is possible to construct functional signal peptide variants by swapping the structural domains of different signal peptides. On this basis a new method was developed which allowed to further increase the export efficiencies of the most efficient signal peptides detected in the screening, by constructing artificial signal peptide variants.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	14.06.2011
Dateien geändert am:	14.06.2011
Promotionsantrag am:	05.03.2010
Datum der Promotion:	18.06.2010