Dokument: Steigerung der Signalstärke und der Photostabilität von Fluorophoren in der Einzelmolekülspektroskopie

Titel:	Steigerung der Signalstärke und der Photostabilität von Fluorophoren in der Einzelmolekülspektroskopie
Weiterer Titel:	Increase in Signal Strength and Photostability of Fluorophores in Single Molecule Spectroscopy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17035
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110121-104915-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pfiffi, Daniela [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.01.2011 / geändert 13.01.2011
Stichwörter:	Einzelmolekülspektroskopie, Fluoreszenz, Signalsteigerung, Photostabilität, Fluorophore
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	In Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimente wird die Signalstärke und Photostabilität der verwendeten Fluorophore hauptsächlich durch Übergänge in nicht fluoreszierende Dunkelzustände wie den Triplettzustand oder Radikalzustände limitiert. Wird die Bevölkerung der beiden Zustände unterdrückt oder die Geschwindigkeitskonstante der Deaktivierung erhöht, kann die Signalstärke des Farbstoffs auf die des theoretisch erreichbaren 2-Niveausystems steigen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden in der vorliegenden Arbeit neue Verbindungsklassen als Additive eingesetzt, die in der Lage sind, über Energie- und Elektronentransfermechanismus gleichzeitig beiden Dunkelzustände des Fluorophors löschen. Es wurden Verbindungen aus den Substanzklassen der Diphenylhexatriene, Cyclooctatetraene und Azobenzole hinsichtlich ihrer Eignung als photoprotektive Additive für den Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 untersucht. Die Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie erlaubte einen detaillierten Einblick in die Löschmechanismen und in photophysikalische und photochemische Prozesse von Rhodamin 123. Die maximale Steigerung des Fluoreszenzsignals um einen Faktor fünf erzielte ein Azobenzolderivat, dass neben einem sehr effizienten Triplettenergietransfer gleichzeitig in der Lage war, das durch Photooxidation entstandenen Radikalkation von Rhodamin zu reduzieren. Die detaillierte Analyse der konzentrationsabhängigen Oxidationsprozesse ermöglichte die Bestimmung der separaten Geschwindigkeitskonstanten der Oxidationsprozesse aus dem ersten angeregten Singulett- und Triplettzustand. Dabei zeigten einige Löschmoleküle eine Tendenz zu Elektronentransferreaktionen, die die Bildung von Radikalzuständen fördern. Durch stationäre Photozerstörungsmessungen konnten verschiedenen Mechanismen, die zur irreversiblen Zerstörung des Rhodamins führen, aufgeklärt werden. Messungen in Abwesenheit von Luftsauerstoff erlaubten erstmals die Quantifizierung des Einflusses von gelöstem Sauerstoff auf die Photozerstörung. Wurde der Triplettlöschers Sauerstoff durch Additive wie Azobenzole oder Cyclooctatetraen-Derivate ersetzt, konnte die Geschwindigkeit der Photozerstörung um das fünfzigfache verringert werden. Das Azobenzolderivat zeigte auch bei Fluoreszenzfarbstoffen, die im roten Spektralbereich absorbieren (z.B. Atto 647N) und daher geringere Triplettenergien besitzen, eine gute Triplettlöscheffizienz. Anhand von fluoreszenzmarkierten DNA-Proben konnte Anwendbarkeit der photoprotektive Additive auf biologische Systeme bestätigt werden. In Bichromophoren, in denen eine photoprotektive Gruppe kovalent an den Fluorophor gebunden wurde, konnte ein komplexer Mechanismus von Energie- und Elektronentransfer beobachtet werden. Durch die Kopplung eines Azobenzolderivats an ein Rhodamin-Grundgerüst fand in sauerstofffreier Umgebung eine Signalsteigerung aufgrund eines intramolekularen Triplettenergietransfers statt. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass beim Einsatz von photoprotektiven Additiven zur Steigerung des Fluoreszenzsignals verschiedene Elektronen- und Energietransferreaktionen berücksichtigt werden müssen. Bei der Auswahl eines geeigneten Löschmoleküls sind detaillierte Kenntnisse über die photophysikalischen und photochemischen Prozesse des Fluoreszenzfarbstoffs erforderlich. Auf diese Art können durch Additive induzierte Übergänge in unerwünschte Dunkelzustände vermieden werden. Die untersuchten Systeme zeigten sowohl in biologischer Umgebung erfolgreiche Wirkung als auch bei gebräuchlichen Akzeptorfarbstoffen gute Effekte und sind daher auch für den Einsatz in Einzelmolekül-FRET-Experimenten geeignet. In single molecule fluorescence experiments the signal strength and photostability is often limited by transitions in non-fluorescent states like triplet or radical states. By suppressing undesired populations, or increasing the corresponding deactivation rates of undesired populations, the fluorophore can theoretically achieve the signal strength of a 2-level system. In order to realize this goal, new compounds were used as additives, which are able to quench simultaneously both dark states of the fluorophore via electron and excitation energy transfer mechanisms. Substances with structures based on diphenylhexatriene, cyclooctatetraene and azobenzene were investigated with respect to their applicability as photoprotective agents for the fluorophore rhodamine 123. Fluorescence correlation spectroscopy allowed a detailed insight into the quenching mechanisms and the photophysical and photochemical processes of rhodamine 123. The most promising signal increase by a factor of five was caused by an azobenzene derivative, which was able to quench the triplet state via energy transfer and to reduce simultaneously the photooxidized fluorophore. From the detailed analysis of the concentration dependent oxidation processes the separated oxidation rate constants of oxidation processes from the first excited singlet and triplet state were obtained. Some quenchers showed the tendency to enhance the formation of radical states. In steady-state photostability experiments different mechanisms were revealed, which led to the irreversible destruction of the rhodamine. Experiments under deoxygenated conditions allowed the quantification of the influence of oxygen on the photostability of the fluorophore. Replacing the triplet quencher oxygen by an additive like azobenzene or cyclooctatetraene derivatives reduced the photodestruction by a factor of 50. The triplet states of fluorescent dyes that absorb in the red spectral region (e.g. Atto 647N) and therefore have lower-lying triplet energies were efficiently quenched by the azobenzene derivative. Investigations on a fluorophore linked to a DNA-sample confirmed applicability of the photoprotektive additives in biological systems. In bichromophores, in which the photoprotective group is covalently bound to the fluorescent dye, a complex mechanism involving energy- and electron transfer reactions was found. By coupling an azobenzene derivative to a rhodamine dye an increase in fluorescence signal due to an intramolecular triplet energy transfer was observed under deoxygenated conditions. The results of this thesis show, that different electron and energy transfer reactions have to be regarded when using photoprotective agents in fluorescence experiments. To select a suitable quencher detailed knowledge about the photophysical and photochemical processes of the fluorophore is required. Thus quencher induced transition to non-desired states can be avoided. The additives showed beneficial effects on fluorophores in a biological environment as well as on common acceptor dyes and are therefore proper quenchers for the application in single-molecule FRET experiments.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Physikalische Chemie und Elektrochemie
Dokument erstellt am:	21.01.2011
Dateien geändert am:	21.01.2011
Promotionsantrag am:	16.04.2010
Datum der Promotion:	05.07.2010