Dokument: A Metagenomic Approach towards Novel LOV domain containing Blue-Light Photoreceptors

Titel:	A Metagenomic Approach towards Novel LOV domain containing Blue-Light Photoreceptors
Weiterer Titel:	A Metagenomic Approach towards Novel LOV domain containing Blue-Light Photoreceptors
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15427
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100628-111913-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pathak, Gopal [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,17 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.06.2010 / geändert 23.06.2010
Stichwörter:	Metagenome, Blue light, LOV domain, Photoreceptor
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	LOV-Domänen enthaltende, Blaulicht- (BL-) sensitive Proteine waren erstmals in Arabidopsis thaliana identifiziert worden (Phototropine). Seitdem wurden diese Proteine in steigender Menge in einer Vielzahl prokaryotischer Genome entdeckt. Dies gelang bisher auf der Basis Genom-sequenzierter, kultivierbarer Mikroorganismen. Seit einiger Zeit findet ein neuer Ansatz, genannt „Metagenomics“ Anwendung, nachdem akzeptiert wurde, dass mehr als 99% aller Mikroorganismen auf der Basis gegenwärtiger Kultivationstechniken nicht zugänglich sein würden. Diese bisher verborgene prokaryotische Diversität wird zunehmend als Reservoir für neuartige Gene mit biotechnologischer Bedeutung betrachtet. In der hier präsentierten Arbeit wird ein derartiger metagenomischer Ansatz für die Identifizierung LOV-Domänen enthaltender Proteine angewendet. Für diesen Zugang wurde ein micro-array entwickelt, der 149 Oligonukleotide mit einer Länge von jeweils 54 Basen enthielt. Die Sequenzen ergaben sich aus Consensus-Motiven von BL-Photorezeptoren. Ausgiebige und detaillierte Kalibrierungen des Array wurden unter Verwendung von genomischer, plasmid- und cosmid-basierter DNA und gene-libraries im Vorfeld durchgeführt, um die Effizienz, Selektivität und Sensitivität zu bestimmen. Der micro-array wurde dann verwendet, um cosmid-klonierte DNA aus einer library von ca. 2000 Klonen zu „screenen“, die aus einer thermophilen Fraktion einer Bodenprobe erhalten worden war. Es gelang, ein nauartiges Gen aus einem 40 kb-Insert zu identifizieren und zu isolieren, das für ein Multi-Domänen-Protein mit mehreren PAS- und einer LOV-Domäne, einer Histidin-Kinase und einem anfusionierten „response regulator“ bestand. Im Vergleich aller bisher bekannten LOV Domänen wies diese neuartige Domäne die größte Sequenzähnlichkeit zu zwei Proteinen auf: Zum einen zu einer LOV-Domäne aus Kineococcus radiotolerans SRS30216 (58 %) und zum anderen zu einer entsprechenden Domäne (57 %) aus Methylibium petroleiphilum PM1. Die LOV Domäne aus HT-Met1 wurde subkloniert und heterolog exprimiert. Wir fanden eine LOV-typische Absorption und Photochemie mit einer für prokaryotische LOV-Domänen kurzen Rückkehr-Kinetik. Zusätzlich konnten in weiteren Ansätzen zwei partielle LOV-Domänen Sequenzen identifiziert werden. Dieser Zugang wurde ausserdem erweitert auf Material erhalten aus hochgelegenen Seen in den Argentinischen Anden und auf Cyanobakterien, die aus einer Wüstenregion isoliert wurden. Auch in diesem Material konnten LOV Domänen-kodierende Sequenzen isoliert werden. Zusätzlich wurde eine weitere Sequenz-basierte Methode auf der Basis vorhandener Metagenomics-Datenbanken durchgeführt, die durch Datensammlung aus verschiedenen Habitaten entstanden sind. Durch diese Suche wurden unter Verwendung des konservierten Bereichs 231 neuartige LOV Domänen identifiziert. Die Mehrheit dieser Sequenzen entstammte Materials der „Global Ocean Sampling Expedition“, allerdings wurden LOV Domänen aus Metagenomen gefunden, die aus extremen Umgebungen stammten, z.B., aus hypersalinen Seen, sauren Abwässern von Minen (pH 0.8, 42 °C) oder Wasseraufbereitungs-Anlagen stammten. Eindeutig identifizierte Proben stammten aus Temperaturbereichen zwischen 1.46 und 42 °C, wobei rein thermophile Habiltate ausgeschlossen waren. Ein Anteil von 73 % (169 von 231) der gefundenen Sequenzen zeigte eine Sequenz-Abweichung von mehr als 20 %, unabhängig von der Tatsache, dass sie eindeutig als LOV Domänen identifiziert wurden. Die Neuartigkeit der gefundenen Sequenzen ergab sich auch aus eine „maximum lokelihood phylogenetic tree“. Sogar in einem kürzlich präsentierten Cyano-Phagen Metagenome wurden Sequenzen für LOV Domänen nachgewiesen, dies möglicherweise als Effekt eines horizontalen Gentransfers. Die praktisch ubiquitäre Verbreitung der LOV Domänen in diesen Metagenomen, die weltweit aus einem breiten Bereich verschiedener Umweltproben stammen, unterstreicht die bedeutende physiologische Rolle dieser Photorezeptoren in der Licht-induzierten Signaltransduktion für eine Adaptierung an verschiedene Stress-Faktoren und vergleichbare Überlebensmechanismen. LOV domain-containing blue light (BL) receptor proteins, which were initially identified from Arabidopsis thaliana, have since then been reported from a significant and rapidly growing number of prokaryotes. This was made possible by a genome-level investigation of culturable microorganisms sequenced so far. Recently, a new field of molecular biology called “metagenomics” emerged after the realization that more than 99% of all microbes are inaccessible by the cultivation techniques available currently. This hidden prokaryotic diversity has been regarded as a potential reservoir for the novel genes of biotechnological importance. In the work presented here, a metagenomic approach was applied to characterize LOV domain-containing BL receptor proteins. For this approach, a DNA microarray was developed that carried 149 54-mer oligonucleotides designed on the basis of consensus sequences of BL-photoreceptor encoding genes. Elaborate calibration experiments were performed with genomic, plasmid, and cosmid DNA, and even with entire gene libraries to determine the efficiency, selectivity and sensitivity of the array. The array was then used to screen the cosmid-cloned DNA from a library containing about 2000 clones which was constructed from the thermophilic fraction of a soil sample. A novel gene (ht-met1) could be isolated from a 40-kb cosmid clone insert, which encoded a protein consisting of several PAS domains, a LOV domain associated to a histidine kinase and a response regulator domain. From all reported LOV-domain proteins, the novel gene showed highest similarity to a known sequence from Kineococcus radiotolerans SRS30216 (58 % identity for the LOV domain only) and to a gene from Methylibium petroleiphilum PM1 (57 % identity for the LOV domain only). The LOV-domain region of ht-met1 was subcloned and expressed yielding a fully functional, flavin containing LOV domain that showed typical LOV-photochemistry with a fast dark recovery. Aside from HT-Met1 LOV, further two partial LOV domains were isolated from an Elbe River metagenome using the newly developed array. This approach was extended for the screening of environmental strains from high altitude Andean lakes in Argentina and cyanobacterial strains from a desert environment. Also in this material we could detect LOV domains in several of the strains. A further sequence-based investigation of LOV domain proteins from various environmental sample datasets was performed. A total of 231 LOV domains could be assigned via the highly conserved core region of this protein domain from already available metagenomic datasets. The majority of the putative LOV domains were originated from the Global Ocean Sampling expedition, but LOV domains were also found in metagenomes from extreme environments such as hypersaline ponds, acidic mine drainage (pH 0.8, 42 oC) or wastewater treatment facilities. Positively identified samples were found in material originating from 1.46 oC to 42 oC (excluding the simulated thermophilic samples). A proportion of ca. 73% of these identified gene fragments (169 out of 231) showed a sequence divergence of more than 20% from data base-deposited LOV-domain sequences originated from previously known species, despite the fact that they could clearly be identified as LOV domains. Sequence novelty was also observed in a subfamily approach determined by a maximum likelihood phylogenetic tree. More interestingly, a recently released phage metagenome contains LOV domain sequences, probably being acquired as an event of horizontal gene transfer. The virtually ubiquitous presence of LOV domains in metagenomes obtained worldwide from a wide range of environmental conditions emphasizes the important physiological role of these photoreceptors in light-induced signal transduction, stress adaptation and related survival mechanisms.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	28.06.2010
Dateien geändert am:	23.06.2010