Dokument: Interaktions- und Sekretionsverhalten des "Dichte-Granula" Proteins GRA9 von Toxoplasma gondii

Titel:	Interaktions- und Sekretionsverhalten des "Dichte-Granula" Proteins GRA9 von Toxoplasma gondii
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=11567
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090626-084322-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Spekker, Katrin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,95 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.06.2009 / geändert 22.06.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Däubener, Walter [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	T. gondii ist ein obligat intrazellulärer Parasit und Verursacher einer humanmedizinisch relevanten Zoonose. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde GRA9 als ein neues sekretorisches Protein von T. gondii beschrieben. Das Ziel dieser Arbeit war es, dieses neu identifizierte, hauptsächlich an membranösen Strukturen lokalisierte GRA9-Protein biochemisch und funktionell bezüglich seines „Targeting“ in der Parasitophoren Vakuole (PV), seiner Membran-Assoziation sowie seines Protein-Interaktionsverhaltens zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass GRA9 mit GRA1 innerhalb der PV und auch mit GRA3 und GRA5 interagiert, die beide an der Membran der Parasitophoren Vakuole lokalisiert sind. Weitere Untersuchungen mittels Immunfluoreszenz- und Co-Immunpräzipitationsanalysen führten zu dem Ergebnis, dass die identifizierten GRA9-Interaktionspartner auch untereinander interagieren und damit in vivo wahrscheinlich als multimolekulare GRA1-, GRA3-, GRA5- und GRA9-Komplexe vorliegen. Aus Literaturbefunden ist bekannt, dass Alpha-helikale Strukturen bzw. hydrophobe Aminosäuresequenzen und potentiell auch PEST-Regionen das Interaktionsverhalten von Proteinen determinieren. Durch Analyse selbst erzeugter GRA9-Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, dass die potentiellen Interaktionsdomänen im GRA9-Molekül jeweils nicht alleine für das Interaktionsverhalten von GRA9 innerhalb der Parasitophoren Vakuole als auch mit den identifizierten Interaktionspartnern verantwortlich sind. Diese Befunde wurden zusätzlich durch Zellfraktionierungsmethoden und Western-Blot-Analysen bestätigt. Erst eine Deletion mehrer Bereiche, die durch eine C-terminale Verkürzung von GRA9 erzielt wurde, führte zu einer deutlichen Veränderung des Interaktionsverhaltens von GRA9. Die C-terminalen Verkürzungen zeichnen sich durch den Verlust von zwei hydrophoben Domänen einschließlich der PEST-Domäne bzw. einer hydrophoben Domänen sowie der PEST-Sequenz aus. Beide verkürzten Proteine zeigen deutliche Veränderungen im Interaktionsverhalten, wie z.B. die abgeschwächte Fähigkeit zur Interaktion mit anderen GRA-Proteinen, ein gestörtes „Targeting“ in der Parasitophoren Vakuole oder eine gestörte Sekretion in das Lumen der Parasitophoren Vakuole. Die Identifikation von Interaktionspartnern von GRA9 und von funktionellen Sequenzbereichen innerhalb des GRA9-Proteins, die das „Targeting“- und Membran-bindungsverhalten von GRA9 beeinflussen, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der physiologischen Aufgabe von GRA9 beim Stoffaustausch zwischen Parasit und Wirtszelle. Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that causes persistent infections in a broad range of warm-blooded vertebrates, including human beings. Since prior research described GRA9 as a new secretory protein of T. gondii, which is mainly localised at the parasitophorous vacuole (PV) membranes, the objective of this PhD-thesis was to biochemically and functionally characterise the targeting behaviour of GRA9 within the PV, its association with the membranes and the protein-interaction of this newly identified protein. In this study we were able to detect an interaction between GRA9 and GRA1, which remains primarily in the lumen of the PV and between GRA9 and the PV-membrane-associated proteins GRA5 and GRA3. Further immunofluorescence analysis and co-immunoprecipitation assays demonstrated that the identified GRA9-interaction partners GRA1, GRA3 and GRA5 bind to each other as well. These results indicate that GRA1, GRA3, GRA5 and GRA9 are closely associated with each other and exist probably in vivo as multimeric complexes. From previously published findings it is known, that alpha-helical structures, as well as hydrophobic amino acid sequences and potentially PEST-regions, determine protein-protein interactions. Based on constructed GRA9 deletion mutants we showed that each potential domain of GRA9 was neither individually responsible for the GRA9 interaction behaviour within the parasitophorous vacuole nor with the identified GRA9 interaction partners. These findings were confirmed by cell fractionation assays and western blot analysis. Only the deletion of multiple domains, created by the construction of GRA9 mutant forms truncated in its c-terminus, led to a significant change of the interaction behaviour of GRA9. The c-terminal truncated GRA9 constructs lead to a loss of either one or both hydrophobic domains as well as the PEST-domain. Both truncated proteins exert a distinct influence on the interaction behaviour of GRA9, for example a weaker interaction ability with other GRA proteins, a disturbed targeting within the parasitophorous vacuole or a disturbed secretion into the lumen of the PV. The identification of interaction partners as well as functional domains of GRA9, which influence the GRA9 targeting and membrane association is an important step to understand the function of GRA9 in nutrient transport between the parasite and the host cell.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	26.06.2009
Dateien geändert am:	22.06.2009
Promotionsantrag am:	19.09.2008
Datum der Promotion:	17.11.2008