Dokument: Identifizierung und Charakterisierung von IFN-gamma regulierten Effektormolekülen (mGBP7, SSPII) in der antimikrobiellen Immunantwort

Titel:	Identifizierung und Charakterisierung von IFN-gamma regulierten Effektormolekülen (mGBP7, SSPII) in der antimikrobiellen Immunantwort
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10225
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090303-094610-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Beuter-Gunia, Cornelia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,31 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.01.2009 / geändert 26.01.2009
Stichwörter:	murine GTPase, 65kDa GBP, mGBP7, Interferon gamma, antimikrobielle Effektoren
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Zytokine IFN und TNF induzieren eine starke antimikrobielle Immunantwort gegen verschiedene Pathogene. Neben bekannten antimikrobiellen Effektorsystemen (z.B. RNI, ROI) zeichnet sich eine Klasse von Proteinen als hochgradig IFN induzierbar aus: die murinen 65 kDa Guanylat-bindenden Proteine (mGBPs) 1-10. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Etablierung der Real-time PCR für die zehn Familienmitglieder der mGBPs ein umfangreiches Expressionsprofil erstellt werden. Dadurch konnte die IFN abhängige Expression in Ana-1 Makrophagen von mGBP1 bis mGBP5 belegt werden. Es stellte sich dabei zusätzlich heraus, dass die hoch homologen „neuen“ Mitglieder mGBP6, 7, 8, 9 und 10 auch zu den IFN induzierten GTPasen zu zählen sind. Die Expression der gesamten Genfamilie zeigte sich auch in der in vivo Infektion mit Listeria monocytogenes als stark induzierbar nach der Infektion. Im Verlauf der Arbeit konnte mGBP7 eingehender charakterisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass mGBP7-Protein nach der in vivo Infektion mit L. monocytogenes in der Leber und der Milz sowie nach der Infektion mit dem intrazellulären Parasiten Toxoplasma gondii in der Leber und der Lunge induziert wird. Die transkriptionelle Expression von mGBP7 wurde in Ana-1 Makrophagen durch IFN und IFN/TNF induziert, während in Knochenmarksmakrophagen auch IFN sowie die TLR-Agonisten LPS und poly (I:C) die mGBP7 mRNS Synthese induzierten. Die Expression von mGBP7 geschieht in Makrophagen dabei generell IRF-1 unabhängig, sodass hier das beschriebene ISRE Element nicht funktionell ist, im Gegensatz zur klassischen IRF-1 abhängigen mGBP2 Transkription. Zusätzlich zeigte sich in diesen Zellen ein weiterer interessanter Regulationsmechanismus durch TNF: trotz Kostimulation mit IFN wird kein mGBP7-Protein in Makrophagen bei gleichzeitiger TNF Stimulation produziert. TNF scheint über noch nicht beschriebene Mechanismen die Proteinsynthese von mGBP7 zu inhibieren. Ein weiterer Unterschied der Regulation von mGBP7 im Vergleich zu mGBP2 ist das Fehlen des mGBP7-Proteins in embryonalen Fibroblasten nach IFN Stimulation. Die Überexpression von mGBP7-eGFP bzw. -DsRed -Fusionsproteinen in RAW Makrophagen oder Fibroblasten zeigten, dass mGBP7 granulär bzw. in vesikelartigen Strukturen in der Zelle vorliegt. Nach Infektion mit dem avirulenten T. gondii Stamm ME 49 in IFN stimulierten Makrophagen und Fibroblasten konnte eine Translokation der vesikulären mGBP7-Proteine zur parasitophoren Vakuole des Parasiten beobachtet werden. Gezielt eingebrachte Mutationen in der G-Domäne von mGBP7 hatten unterschiedliche Auswirkungen auf die Distribution des Proteins innerhalb der Zelle. So kam es zu einem völligen Verlust der vesikulären Struktur bei gezielten Punktmutationen in den G1 (G(X)4GKS/T) und G2 (T) GTP-Bindemotiven, während bei Mutationen in den G3 (DXXG) und G4 (RD) Motiven die vesikuläre Verteilung von mGBP7 erhalten blieb. Auch wurde durch alle diese Mutationen die Fähigkeit von mGBP7 weitgehend inhibiert mit der PV von T. gondii zu kolokalisieren. Vorarbeiten zur Erstellung einer mGBP7 defizienten ES-Zelllinie sollen zur Generierung einer mGBP7 defizienten Mauslinie führen und die biologische Funktion von mGBP7 in der Infektionsabwehr zukünftig klären helfen. Ein weiteres Gen, welches durch IFN und TNF Stimulation in murinen Makrophagen differenziell exprimiert wird, ist SSPII. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde dieses noch unbekannte Gen näher charakterisiert. Mittels RACE PCR konnte die Gesamtlänge des Gens auf 730 nt bestimmt werden. Die 237 nt lange kodierende Sequenz ergibt ein kationisches Protein in der Größe von 78 AS und einem Molekulargewicht von 8,7 kDa. Während SSPII keine bekannten Domänenstrukturen aufweist, kodieren die ersten 24 AS jedoch für ein N-terminales Signalpeptid. Dieses Signalpeptid ist für die im Westernblot nachgewiesene Sekretion des Proteins aus der Zelle verantwortlich. Lokalisationsexperimente bei denen SSPII mit DsRed oder GFP am C-Terminus von SSPII fusioniert vorlag, zeigten eine subzelluläre Lokalisation von SSPII mit dem Golgi-Apparat und dem Endoplasmatischem Retikulum innerhalb der Zelle Dagegen kam es nach Maskierung der N-terminalen Signalsequenz durch DsRed am N-Terminus von SSPII zur Fehllokalisation und diffusen Verteilung des Proteins in der gesamten Zelle kam. Somit konnte gezeigt werden, dass SSPII ein sezerniertes Protein ist. Expressionsversuche zeigten darüber hinaus, dass in Knochenmarksmakrophagen nach Stimulation mit den Zytokinen IFN, IFN/TNF, TNF, IFN aber auch durch die TLR-Agonisten LPS und poly (I:C) die Expression von SSPII induziert wird. Des Weiteren konnte die Induktion der mRNS Expression auch in den in vivo Infektionen bei C57BL/6 Mäusen mit den Pathogenen L. monocytogenes, T. gondii und Trypanosoma cruzi detektiert werden. Dabei konnte auch das Wt Protein im Westernblot nach L. monocytogenes Infektion detektiert werden, womit SSPII als ein funktioneller Genlokus definiert werden kann. Um die Rolle von SSPII in der Infektabwehr weiter zu definieren, wurde eine ES-Zelllinie etabliert, welche ein nicht funktionelles SSPII Allel besitzt. Die Generierung einer SSPII defizienten Mauslinie kann in künftigen Arbeiten für die weitere Charakterisierung der biologischen Funktion von SSPII verwendet werden. The cytokines IFN and TNF induce a potent immune respons against various pathogens, including well described anti-microbial effector mechanisms such as RNI and ROI. In addition to this a group of murine proteins with marked IFN inducibility has become recognised, the guanylate-binding proteins (mGBP) 1 to 10. In this dissertation a comprehensive expression profile of the 10 members of this class of proteins was established using real-time PCR. Using this tool the IFN dependent expression profile of mGBP1 to mGBP5 in Ana-1 macrophages could be elucidated. Furthermore it was demonstrated that the highly homologous “newer” members, mGBP6-10, were also IFN induced and that the expression of the whole family is induced by in vivo infection with Listeria monocytogenes. In the course of this project it was found that, after infection with L. monocytogenes, the protein mGBP7 was expressed in the liver and spleen and also that, after infection with the intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii, expression in the liver and lung was induced. The transcriptional expression of mGBP7 in Ana-1 macrophages was induced by IFN whereas in bone marrow macrophages IFN and the TLR agonists LPS and poly (I:C) also induced a marked mGBP7 expression. The expression of mGBP7 was, generally speaking, independent of IRF-1 and thus the ISRE element is, in contrast to the classical IRF-1-dependant mGBP2 transcription, non-functional. These cells demonstrated a further interesting regulatory mechanism in that despite co-stimulation with IFN TNF stimulation induced no expression of mGBP7 protein. TNF appears to inhibit the protein mGBP7 synthesis by an unknown mechanism. A further difference in the regulation of mGBP7 compared to mGBP2 is that in contrast to the latter no mGBP7 is detectable in embryonal fibroblasts after IFN stimulation. Overexpression of mGBP7-eGFP or mGBP7-DsRed fusion proteins in RAW macrophages or fibroblasts showed that mGBP7 is to be found in granular or vesicular structures in the cytoplasm. Infection of IFN stimulated macrophages and fibroblasts with the avirulent T. gondii strain, ME 49, resulted in a translocation of the vesicular mGBP7 protein to the T. gondii parasitophorous vacuole (PV). Targeted mutations in the G-domain of mGBP7 had various effects on the distribution of the protein in the cytoplasm. A point mutation in the G1 (G(X)4GKS/T) and G2 (T) GTP-binding motif resulted in the complete loss of the vesicular distribution whereas the point mutation in the G3 (DXXG) and G4 (RD) motifs had no such effect. All these mutations inhibited the co-localisation of mGBP7 with the PV. Work towards the establishing of a mGBP7 deficient ES-cell line in order to generate a mGBP7 knock out mouse is underway. This should help to better describe the function of mGBP7 in the immune response to infection. A further gene differentially expressed in macrophages after stimulation with IFN and TNF is SSPII. The gene for this protein was characterized in the second part of this thesis. Using RACE-PCR the full length of this gene was determined to be 730 nt. The 237 nt coding sequence produces a cationic protein of size 78 AA with molecular mass of 8,7 kDa. Whereas SSPII does not demonstrate a known domain structure, the first 24 AA represent an N-terminal signal peptide. This signal peptide could be shown by western blot to be responsible for the translocation of the protein out of the cell. Using SSPII labeled with DsRed or GFP at the C-terminal end it was shown that the protein is to be found in the Golgi apparatus and endoplasmatic reticulum, whereas masking the N-terminal signal peptide lead to a diffuse cytoplasmic distribution throughout the cell. Thus it is concluded that SSPII is a secreted protein. Expression of SSPII was induced by stimulation of bone marrow macrophages with the cytokines IFN, IFN/TNF, TNF, IFN and also the TLR agonists LPS and poly (I:C). Moreover the in vivo infection of C57BL/6 mice with the organisms L. monocytogenes, T. gondii and Trypanosoma cruzi induced the mRNA expression of SSPII. In this infection model the wildtype protein was detected by western blot after infection with L. monocytogenes thus confirming SSPII as a functional gene locus. To investigate the role of SSPII in infection an ES cell line with a non functional SSPII allele was created. This may be used to create a SSPII deficient mouse line, which will be decisive in the future investigation of the biological function of SSPII.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	03.03.2009
Dateien geändert am:	26.01.2009
Promotionsantrag am:	30.09.2008
Datum der Promotion:	18.12.2008