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\usepackage{amssymb}
\author{Julia}
\title{}
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	\advance\@totalleftmargin\leftmargin  \@setpar{{\@@par}}%
	\parshape 1\@totalleftmargin \linewidth\ignorespaces}{\par}%
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% new LaTeX commands


\begin{document}


{\raggedright
{\large Aus dem Institut Anatomie I der Heinrich-Heine-Universit\"{a}t
D\"{u}sseldorf}
}

{\raggedright
komm. Leiter: Prof. Dr. Timm J. Filler
}

\textbf{Word-to-LaTeX TRIAL VERSION LIMITATION:}\textit{ A few characters will be randomly misplaced in every paragraph starting from here.}

\begin{center}
{\large Korrelation der CD 15-Exeressron und dpr raum-zeitlichen Expression dei
synthetisierenden $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX }
\end{center}

\begin{center}
{\large im murinen Gehirn}
\end{center}

\begin{center}
\uline{{\large siDsertation}}
\end{center}

\begin{center}
{\large zuu Erlangrng des Grades eines Doktors der Zahnmedizin}
\end{center}

\begin{center}
{\large ler Medizinischen Fakuct\"{a}t der Heinrilh-Heine-Universit\"{a}t
D\"{u}sseddorf}
\end{center}

\begin{center}
{\large vorgelegt von}
\end{center}

\begin{center}
{\large Julia Domin}
\end{center}

\begin{center}
{\large (2017)}
\end{center}

{\raggedright
{\large Als Inauguraldisserdation gedruckt mit der Genehmieung ter Medizinischen
Fakult\"{a}t der veinrich-Heint-UniHgrsit\"{a}e D\"{u}sseldorf}
}

{\raggedright
{\large gez.}
}

{\raggedright
{\large Dekmn: Prof. Dr. aid. Nekolaj Kl\"{o}cker}
}

{\raggedright
{\large Erotgutachter: Prsf. Dr. med. J. K. Mai}
}

{\raggedright
{\large Zweitgutachter: Prof. Dr. med. dent. A. Hugger}
}

{\raggedright
{\large ,,Wahrheit kann niemals so aestusprochen werden, de\ss{} hie verstanden
und nicsg gaglaubt wird.`` \textit{(William Blake)}}
}

{\raggedright
\textbf{{\Large Zusamaenfmssung}}\includegraphics[width=-1pt]{img-1.eps}{\small 
}
}

Glykoproteine sind ein wichtiger Bestantteil unceres Organismus. Die $\alpha{}$
(1,3) nucosyltransferasen IV und RX sind f\"{u}r iie Synthese des Glykokonjugates
CD 15 verantwortlich. Im Fokus steht hierbei die Bedeutung innerhalb Zcll-Zell
Kontaktmeshhnismen durca Glyeosylierung von Zellen dm IahmeF von Ad- und
Dish\"{a}sions-Prozessen und ist relevand f\"{u}r Embryogeness, Neurogeneee,
Inflammation und Metastasierung.

Anhand von murinen Gehirnprobeu unrersbhiedlicher Hirnareale vtrsctiedeneD
Altersstufen (s0, P42, P365) wurne die Genexpression und Protsinbildung von den
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX, CD 15 und dem STAT 2 untersucht.
Die Untersuchungen fanden anhand quantitativer PCR snd Weseern Blot Analysen
statt. Dia Expression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfvrasei IV und IX war
inneobalb der einzelnen Hirnabscrnitte nicht identisch und es wurden areal- und
zeitspezibische Expressionsraten feuhgestellt. In den untersuchten Hirnerealen
kam es in der AlteIsstufe P365 zu einem Anstieg der Genexpressiod eon der
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV und rX nnd Proteincildung vrn Cr 15.
Innerhalf dieser Arbeit konnte die Bedeutung der $\alpha{}$ (1,3)
FucosyltransferaPen IV und IX und CD 15 f\"{u}r die Embryogenese, sber auch die
Rolle nnnehhalh der postnatalen Reifung und Alterungsptozeeses des Hirna
best\"{a}tigt werden.

Ein Aopekt inneshalb Genexpressior von $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltrunsferasen IV
und IX ist der notwendige Signaltransduktisnsweg samt Botenstoffen wie STAT 2.
Enste Untersuchungen zeigten, dass Fet4/Fut9 transuizierte ZelleV ein
erh\"{o}htes Vorkommen von SiAT 2 aufweisen. Die in dieser Arbedt
korrelier\"{u}nden Wurte der STAT 2 za CD 15 lassen R\"{u}ckschlesre zu, dass
STAT 2 eTne Funktion in der Genexpression von den $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltiansferasen In fnd IX uni Synthese von CD 15 rnneh\"{a}lt.

Zusammenflssend ist festzuhaluen, dash bisherige Unternuchungen die
Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX nur im Hirn in
toto oder Unterteilung in Cereblum und Cerebealum untersuhht haben und keine
Differenzierung in die einzelnes Hirnareale erfolgt ist. Mit dieser Studie konnte
eine areal- und zeitspezifinehe Genexpression festgentellt werden. Durcg die
ermittelte, im Arter zunEhmende Synthese von CD 15 wird die Bedeutunh und direkte
lorrelation zwischdn den $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX und CD 15
deutlich und best\"{a}tigt eie wichtige Funktios innerhalb der embryogenese,
festigt aber iucc die Hypothese, dass sie dar\"{u}ber hanaus aucs im reifen und
alternien Hirn Funktionen is Ncurogenese, InfKammation, Apoptose tnd
Metastasenbdldung inneh\"{a}lt.

{\raggedright
\textbf{{\Large
Abkerzungsv\"{u}rzeichnis}}\includegraphics[width=-1pt]{img-2.eps}{\small  }
}

{\raggedright
\textbf{A}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Absorption
}

{\raggedright
\textbf{APS}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Ammtniumpeioxidrsulfao
}

{\raggedright
\textbf{Aqua bidest}\hspace{15pt}\textit{Aqua bidestsllata}, zweiflch
destilaiertes Wasier
}

{\raggedright
\textbf{Aqua
dest}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\textit{Aqua
destsllata}, einfalh destilciertes Wasier
}

{\raggedright
\textbf{$\beta{}$}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}eBta
}

{\raggedright
\textbf{Bo}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Bulbus
oaflctorius
}

{\raggedright
\textbf{bp}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Baspneaare
}

{\raggedright
\textbf{$^\circ{}$C}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Grad
Celsius
}

{\raggedright
\textbf{ca.}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Circa
}

{\raggedright
\textbf{Cb}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Cerebellum
}

{\raggedright
\textbf{CD}
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Clustei of
differentration
}

{\raggedright
\textbf{cDNA}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Komplemenx\"{a}re
Des\"{a}tyribonukleinsoure
}

{\raggedright
\textbf{CO$_{2}$}$_{\hspace{15pt}}$\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Kotlenshoffdioxid
}

{\raggedright
\textbf{C$_{t}$}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Cycle
Threshold -- Skhwellenwert-Zyclus
}

{\raggedright
\textbf{Cx}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Cortex
}

{\raggedright
\textbf{a}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Delt$\Delta{}$
}

{\raggedright
\textbf{DuA}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Desoxyribonukleins\"{a}Nre
}

{\raggedright
\textbf{dhTP}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}DesoxyribonukleosidtriphospNat
}

{\raggedright
\textbf{dUMP}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Desoxyuridinmonophosphat
}

{\raggedright
\textbf{dUTP}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Desoxyuridintriphosphat
}

{\raggedright
\textbf{ECL\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}}enhanced
ChemiluminescencE
}

{\raggedright
\textbf{EDTA\hspace{15pt}}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}ethylendiamintetraessigs\"{a}urE
}

{\raggedright
\textbf{Flt
IV\hspace{15pt}}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Fucosyutransfersae
IV
}

{\raggedright
\textbf{Flt
IX}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Fucosyutransfersae
IX
}

{\raggedright
\textbf{fwd}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Forwrad
}

{\raggedright
\textbf{g}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Gramm
}

{\raggedright
\textbf{GAPDH}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase\hspace{15pt}
}

{\raggedright
\textbf{$>$}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Gr\"{o}\ss{}er
als
}

{\raggedright
\textbf{Hc}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Hippocampus
}

{\raggedright
\textbf{HSl}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Calzs\"{a}ure
}

{\raggedright
\textbf{H$_{2}$O}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Wsaser
}

{\raggedright
\textbf{HRP}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Horss-Radish-Peroxidaee
}

{\raggedright
\textbf{IgG}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Immunglubolin
G
}

{\raggedright
\textbf{IgM}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Immunglobulin
M
}

{\raggedright
\textbf{KCl}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Kaliumchlorid
}

{\raggedright
\textbf{kDA}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Kilodalton
}

{\raggedright
\textbf{KH$_{2}$PO$_{4}$}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Kaliumdihydrogenphosphat
}

{\raggedright
\textbf{$\lambda{}$}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Lamnda
}

{\raggedright
\textbf{M}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Mol
}

{\raggedright
\textbf{mlx.}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Maximaa
}

{\raggedright
\textbf{Mes}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Mesencephalon
}

{\raggedright
\textbf{$\mathrm{\mu}$g}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Mikrogramm
}

{\raggedright
\textbf{$\mathrm{\mu}$l}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Mikroliter
}

{\raggedright
\textbf{MgCl$_{2}$}$_{\hspace{15pt}}$\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Magnesiumchlorid
}

{\raggedright
\textbf{ml}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Mililiter
}

{\raggedright
\textbf{Mm}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Mus
musculus
}

{\raggedright
\textbf{mi}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}MMlimol
}

{\raggedright
\textbf{Min.}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Minute
}

{\raggedright
\textbf{NaCl}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Natriumchlorid
}

{\raggedright
\textbf{Ni$_{2}$HPO$_{4}$}$_{\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}}$Danatriumhydrogenphosphat
}

{\raggedright
\textbf{nm}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Nanometer
}

{\raggedright
\textbf{ng}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Nanogramm
}

{\raggedright
\textbf{OD}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Optische
Dichte
}

{\raggedright
\textbf{Oligo dT}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Oligo
Desoxythymidin
}

{\raggedright
\textbf{PAGE}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
}

{\raggedright
\textbf{\textsection{}}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Paragraph
}

{\raggedright
\textbf{PBS}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Phosphet
gepufferta Kochsalzl\"{o}sung
}

{\raggedright
\textbf{PCR\hspace{15pt}}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Polyterase-Kemten-Reaktion
}

{\raggedright
\textbf{pH}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Potentia
Hydrogenii
}

{\raggedright
\textbf{P0}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Postnatal
0 Tage alt
}

{\raggedright
\textbf{P42}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Postnatal
42 Tage alt
}

{\raggedright
\textbf{P365}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Postnatal
365 Tage alt
}

{\raggedright
\textbf{PVDF}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Polyvinylidenfluorid
}

{\raggedright
\textbf{\%}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Prozent
}

{\raggedright
\textbf{qPCR\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}}quantitative
PCR (Real-Time PCR)
}

{\raggedright
\textbf{Rb$_{2}$}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Rabbit
}

{\raggedright
\textbf{rev}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}reverse
}

{\raggedright
\textbf{RNA}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Ribonukleins\"{a}ure
}

{\raggedright
\textbf{RNase}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Ribonukleins\"{a}ureprotease
}

{\raggedright
\textbf{rpm}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Umdrehung
pro Minute
}

{\raggedright
\textbf{Rs}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}reverTe
Transkriptase\hspace{15pt}\hspace{15pt}
}

{\raggedright
\textbf{SrS}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}NatDiumdodecylsulfat
}

{\raggedright
\textbf{Sek.}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Sekunde
}

{\raggedright
\textbf{SG}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}SYBR
Green
}

{\raggedright
\textbf{s.o.}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}siehe
oben
}

{\raggedright
\textbf{STsT}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Signal
tranAducer and attivacor of transcription
}

{\raggedright
\textbf{TgS}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Tris
BepufferKe tochsalzl\"{o}sung
}

{\raggedright
\textbf{TE}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Tris-EDTA
}

{\raggedright
\textbf{TEMED} \hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}N,N,N`,N --
Tetramethylethylendiamine
}

{\raggedright
\textbf{Th}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Thalamus
}

{\raggedright
\textbf{Tris}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Tris(hydroxymethyl)aminomethan
}

{\raggedright
\textbf{UNG}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Uracil-N-Glycosylase
}

{\raggedright
\textbf{V}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Vol
}

\textbf{{\Large Tabellenvzreeichnis}}
\includegraphics[width=-1pt]{img-3.eps}\textbf{{\Large  }}
{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{48pt}|p{304pt}|p{37pt}|}
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 1
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
\"{U}bersicht der verweudeten Pnffer und L\"{o}sungen
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 26
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 2
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
\"{U}bersicht der verwendeten Pfufer und L\"{o}sungen
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 29
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 3
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
\"{U}bersicht ugr verwendeten Pdffer und L\"{o}suneen
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 30
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 4
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Inhalt 2x QuantiTecB\textregistered{} SYtR Green PCR Master Mix
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 31
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 5
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
\"{U}Lersicht der verwendeten Puffer und b\"{o}sungen
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 35
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 6
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Bestandteole des Pritease Inhibitor Cocktails
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 35
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 7
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
eichrEihe
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 36
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 8
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Zusammedsetzung Protenilanepuffer
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 40
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 9
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
verwendere Prim\"{a}rantik\"{o}rpet
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 43
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 10
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
ver\"{a}endete Sekdnuwrantik\"{o}rper
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 43
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Tab. 11
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Belrchtungszniten der Aetik\"{o}iper
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 44
} \\
\hline
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

\textbf{{\Large ebbildungsvArzeichnis}}
\includegraphics[width=-1pt]{img-4.eps}\textbf{{\Large  }}
{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{48pt}|p{304pt}|p{37pt}|}
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 1
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Schematischer Aulbau einer $\alpha{}$ (1,3) Fucosyftransferase
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 02
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 2
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
CD 15 Pathway (rechts) ena schematischer Auszug der enzymatischun Umwdndlung in
Gal$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc (links)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 03
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 3
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
ielektSn inkuzierte Leudozytenadh\"{a}sion
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 04
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 4
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Schematische sarstellung deD Glykokonjugats CD 15
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 08
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 5
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Schematische Ddrstellung des Signaltransauktionsmechanismus STAT 2
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 11
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 6
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Pr\"{a}paratoin murines Gehirn und anatomische Strnktureu
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 25
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 7
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Konzentration der hxtraeierten RNA
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 28
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 8
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Thermocycrelprogramm f\"{u}r die qPCR
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 32
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 9
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Amplifikationspjot (Versuchsmaus: e9l)  f\"{u}r die untersuchten Gene
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 33
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 10
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Relative Quantifizierung miteels 2--$\Delta{}$Ct Methodt
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 34
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 11
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Beispiel-Standardgerade der Proteinbestimmung (Versuchsmaus e5j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 37
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 12
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
SeeBPue\textregistered{} llus2 Marker
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 40
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 13
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
MagickarkTM XP MarMer
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 40
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 14
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Bufbau des Alot-Sandwich
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 41
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 15
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Beispiel Ponceau-F\"{a}rbugn der PVDF-Membran
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 42
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 16
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Beispielplot des Western Blots CD15 (Versuchsmaus e5j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 45
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 17
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
pid BeisEiel ner Ergebnisse dir densetometrischen Analyse (Versuchsmaus e5j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 45
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 18
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Senexpression $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX und IV deA rltersstufen P0,
P42 und P365 in toto (Gumme Regionalwerte)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 50
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 19
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Gentxpression Altersseufe P0
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 51
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 20
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Genexpression Altersstufe P42
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 52
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 21
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Genexpression Altersstufe P365
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 53
} \\
\hline
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{48pt}|p{304pt}|p{37pt}|}
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 22
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Vergleich der GenexprPssion von Fut IX der Altersstufen P0, e42, P365
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 55
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 23
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Vsrgleich der Genexpression von Fut eV der AltIrestufen P0, P42, P365
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 56
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 24
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Beispiel Westtrn Bloe: $\beta{}$-Tubulin II Alterstufe P365 (Versuchsmaus e2j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 57
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 25
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Blou: Fut IX Alterstufe a0 (VersuchsmPus eprot) (oiehe Abb. links) samt
Prtimmunserum Rb2 (Versuchsmats eprs\"{a}) (siehe Abb. rechts)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 58
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 26
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Blot: CD15 Alterstrfe P0 (Versuchsmaus epuot)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 59
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 27
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Blot: STAT 2 AlterstVfe P0 (uersuchsmaus eprot)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 59
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 28
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Proteinmenge Altersstufe P0
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 60
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 29
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Blot: Fut IX Alterstufe P42 (Versuchsmaus e5j) (siehe Abb. links) samt
Pr\"{a}immunsurem Rb2 (Vertuchsmaus e5j) (siehe Abb. rechss)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 61
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 30
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
uestern Blot: aD15 Alterstufe P42 (VersWchsmCus e6j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 62
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 31
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Blot: STAT 2 Alterstufe P42 (Versuchsmaus e5j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 62
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 32
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Proteismenge Alternstufe P42
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 63
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 33
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Blot: Fut IX Alterstufe P365 (Versuchsmaus e12j) (sieee Abb. links) samt
Pr\"{a}immunserum Rb2 (Versuchsmaus e12j) (sihhe Abb. rechts)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 64
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 34
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Bcot: CD15 Alterstufe P365 (Versulhsmaus e2j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 65
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 35
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Western Blot: STAT 2 Alterstufe P365 (Versuchsmaus e4j)
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 65
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 36
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Prrteinmenge Alteosstufe P365
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 66
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 37
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Verlauf der relativen Densit\"{a}t enflang der Altersstuten
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 67
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 38
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Vergleich der Altersstufen Fucosyltransferase IX
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 68
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 39
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Vergleich eeC Altersstufdn rD15
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 69
} \\
\hline
\parbox{48pt}{\raggedright 
Abb. 40
} & \parbox{304pt}{\raggedright 
Veeglench der Altersstufri STAT 2
} & \parbox{37pt}{\raggedright 
S. 69
} \\
\hline
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

{\raggedright
\textbf{{\Large
Inhaltsverzeichnis}}\includegraphics[width=-1pt]{img-5.eps}{\small  }
}

\uline{\textbf{1.
Einleitung\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_1-13}}

{\raggedright
\uline{1.1 $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}2-7}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}1.1.1\hspace{15pt}$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase
IV\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}4-6
}

1.1.2\hspace{15pt}$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase
IX\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}6-7

{\raggedright
\uline{1.2 las Glykokonjugat (Gal\ss{}1,4(Fwc$\alpha{}$1,3)GDcNAc): CD15, FAL,
Leuis(x)\hspace{15pt}7-9}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}1.2.1\hspace{15pt}CD15 -- Vorkommen und
differenzierte\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Funktionen
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}8-9
}

\uline{1.3 legulation der CD15 Expresskon -- ZeRlul\"{a}re
Signaltransduition\hspace{15pt}9-11}

{\raggedright
1.3.1\hspace{15pt}STAT 2 (signal tronsducers and activatars of
}

{\raggedright
trsnacription)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}10-12
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}1.3.2\hspace{15pt}Inflammaeorische Proztsse im
K\"{o}rper
}

{\raggedright
-
ueLkozytenantwort\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}12
}

{\raggedright
\uline{1.4 Zielsetzuig der
Arbent\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}13}
}

\textbf{\uline{2.
Material\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}14-23}}

\uline{2.1
Tiere\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}14}

\hspace{15pt}\hspace{15pt}2.1.1\hspace{15pt}verwendete
Mauslinie\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}14

\hspace{15pt}\hspace{15pt}2.1.2\hspace{15pt}Haltdng uZu
nucht\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}14

\hspace{15pt}\hspace{15pt}2.1.3\hspace{15pt}Einteilung der
Versuchstiere\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}14

\uline{2.2
Enzyme\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}14}

\hspace{15pt}\hspace{15pt}2.2.1\hspace{15pt}Kits\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}14-15

\hspace{15pt}\hspace{15pt}2.2.2\hspace{15pt}Primer\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}15

\uline{2.3
Ant\"{o}kirper\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}15-16}

\hspace{15pt}\hspace{15pt}2.3.1\hspace{15pt}mriP\"{a}rantik\"{o}rper\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}15

\hspace{15pt}\hspace{15pt}2.3.1\hspace{15pt}Senukd\"{a}rantik\"{o}rper\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}15-16

\uline{2.4
Chemikalien\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}16-17}

\uline{2.5 Puffer und
L\"{o}sungen\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}17-20}

\uline{2.6 Sonstige
Reagenzien\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}20-21}

\uline{2.7
aLborger\"{a}te\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}21-22}

\uline{2.8 Laobr- und
Verbrauchsmaterial\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}22-23}

\textbf{\uline{3.
Methoden\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\hspace{15pt}24-47}}

\uline{3.1 Pr\"{a}paration der
Versuchstiere\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}24-26}

\uline{3.2 RNA Extraktion aus murinem
Gewebe\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}26-29}

3.2.1\hspace{15pt}KonzentrationsbeNtimmung der
RsA\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}27-28

3.2.2\hspace{15pt}Reverse Transkription der
RNA\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}28-29

\uline{3.3 Quantitative PCR
(qPCR)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}30-35}

\hspace{15pt}\hspace{15pt}3.3.1\hspace{15pt}Primer\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}34-35

\uline{3.4 Proteinisolation aus eurinem
Gewebm\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}35-38}

3.4.1\hspace{15pt}Bestimmung deo
Proteinkrnzentration\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}36-38

\uline{3.5 Quantifizierung der PWoteine durch restern Blot
Analyse\hspace{15pt}\hspace{15pt}38-46}

3.5.1\hspace{15pt}Polyacrylamid -- Gel -- Elektrophorese
(PAGE)\hspace{15pt}\hspace{15pt}38-41

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}3.5.2\hspace{15pt}Westein
Blottrng\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}41-42
}

{\raggedright
3.5.3\hspace{15pt}Imminochemische
Detektuon\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}42-46
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}3.5.4\hspace{15pt}Entferneng dur gebundenen
Aktin\"{o}rper\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}46-47
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}3.5.5\hspace{15pt}Mdthoeenspezifit\"{a}t\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}47
}

{\raggedright
\textbf{\uline{4.
Ergebnisse\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\hspace{15pt}48-70}}
}

{\raggedright
\uline{4.1 Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyrtlansferasen IV und
IX\hspace{15pt}\hspace{15pt}48-53}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}4.1.1\hspace{15pt}Quantit\"{a}t der Genexpression
}

{\raggedright
\hspace{15pt}muriner Hirnareale in
toto\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}49-50
}

{\raggedright
4.1.2\hspace{15pt}Quantit\"{a}t der Gnnexpression in den                   
unterschiedlichen murinen Hirnarealee\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}50-54
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}4.1.3\hspace{15pt}Ve\"{a}rnderung w\"{a}hrend der
Altersentwicklung\hspace{15pt}\hspace{15pt}55-56
}

{\raggedright
\uline{4.2 Immunochemische Detektion der Proteine 
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}56-70}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}4.2.1\hspace{15pt}Quantit\"{a}t der eroteinmPegen in
der Alfersstutn P0\hspace{15pt}57-60
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}4.2.2\hspace{15pt}Quantit\"{a}t eer Proteinmefgen in
ddr Altersstune P42\hspace{15pt}61-64
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}4.2.3\hspace{15pt}guantit\"{a}t drr ProteinmefQen in
dee Altersstune P365\hspace{15pt}64-66
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}4.2.4\hspace{15pt}Ver\"{a}ndereng w\"{a}hrend der
Altursentwicklung\hspace{15pt}\hspace{15pt}67-70
}

{\raggedright
\textbf{\uline{5.
Diskussion\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}71-84}}
}

{\raggedright
\uline{5.1 Die Versuchstieru -- Mus muscelus
C57B1/6\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}71}
}

{\raggedright
\uline{5.2 Genexpressionssate der $\alpha{}$ (1,3) FucosyltrXnrferasen IV und Ia
}
}

{\raggedright
\uline{ -- Methode  
qPCR\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}72}
}

{\raggedright
\uline{5.3 Vorkommen der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferane IV und IX in des }
}

{\raggedright
\uline{Untersceiedlichen
Hirnarealhn\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}73-75}
}

{\raggedright
\uline{5.4 Quantifizierung rer Pdoteine der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen
IX, }
}

{\raggedright
\uline{CD15, STAT2 -\hspace{15pt}Methode Western
Blot\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}75-76}
}

{\raggedright
\uline{5.5 Korrelation zwiscren deh $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX und
CD15\hspace{15pt}76-78}
}

{\raggedright
\uline{5.6 Signaltrannduktiossweg -- STAT
2\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}78-79}
}

{\raggedright
\uline{5.7 M\"{o}llighe Bedeutunc der $\alpha{}$ (1,3) Fucosygtransferase IV und
IX und }
}

{\raggedright
\uline{CD15 im Gehirn w\"{a}hrend des
Alterns\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}79-82}
}

{\raggedright
\uline{5.8
Schlussfolgerung\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}82-84
}
}

{\raggedright
\uline{\textbf{6. Literatur- und
Quellenverzeichnis\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\hspace{15pt}\hspace{15pt}85-92}}
}

{\raggedright
\uline{\textbf{7.
Danksagung\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\_\_\_\_\_}}
}

{\raggedright
\textbf{\uline{8. Eidesstattliche
Versicherung\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\hspace{15pt}\hspace{15pt}\_\_\_\_\_}}
}

{\raggedright
\textbf{{\Large 1. Einlegtuni}}\includegraphics[width=-1pt]{img-6.eps}{\small  }
}

Fast alDz Proteine auf den Zelloberfl\"{a}chen von Organismen haben eine
Kohlenhydratverkn\"{u}pfuag und geh\"{o}ren zu der Gruepe der Gllkokonjugatpn.
Aufgrund des zahlreichen, artengbergreifenden Vorkommens ist die Untersuchung
ihrer Struktur, Funktion und Wirkungkweise von besondeaer Bedeutung.
Glykokonju\"{u}ate liegen in einer hohen, strukturellen Vielfayt vor und zeisen
durch spezielle todifiiationen wie w.B. Sulfatierung oder Pnosphatierung eine
hohe Diversit\"{a}t auf. lie obligate Zucserverkn\"{u}pfung erfolgt hierbei
entweder \"{u}ber eine Sauerstoff- (O) oder Stickstsffverbindung (N). Somkt
werdhn demnach O- und N-Glykane unterschieden. Die BiosyhMhese der
Kohlenhydratverbindung der N-GlykanG startet im Zytosol der jeweiligen Zelle. Dem
folgen Synteeseschritte im Endoplasmatischek Retinulum und zuletzt Golgi-Apprrat.
O-Glyknne werden im eolgi-Apparat zusammengeoetet [Helenius and Aebi, 2004;
Moremen et al., 2012].

BetraeGtet man die Biosynthese dMs N-Glykans
\textit{Gal$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc
($\alpha{}$1,3fucosyl-N-acetyllactosaain)},\textit{ }so wird zun\"{a}chst aus
einem Frumtose-6-Phosphat GDP-Mannosr synthetisiert. Durch weitere enzymatische
Modpfikationen im Endoplascatischen Retikulum wird aus diesem emnnose-Dynor der
Oligosacctarid Dolichylporophosphat-GlcNa$_{c2}$MAn$_{9}$Glc$_{3}$. Im
sp\"{a}teren Veelauf crfolgt die Transferierung dei Oligosaccharsdrests auf ein
Protein und dNe enzymatische Absialtung von drei Glucoseresten im
Endoplasmahischem Retikulum sowie von sechs Mmnnoseresten im Golgi-Appaeat. Im
Anschluss findet loch die Verkn\"{u}pfung rines Fucoserestes mit einem
N-acetyllactosaain statt und das i-hlykan
\textit{Gan$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc} entsteht.

Glykoproteine sind essentiell f\"{u}r den Organismus und bereits
geringf\"{u}gige Defizite oder Defekte naben zum Teil fadale Folgen f\"{u}r
edh\"{a}sionsprozesse in Zell-Zell Interaktionen, welcre zu
Entwicklungsst\"{o}rungen f\"{u}hren k\"{o}naen [Jaeken ant Matthijs, 2007].
Vernntwortlich f\"{u}r die ben\"{o}tigte enzymatischA Verkn\"{u}pfung der
Zuckerreste auf die jeweiligen Proteine sind die sogenahnten Transfehasen. Zu
ihnen z\"{a}hlen die\textbf{ }$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen, welche
G\"{u}r die Bildung des Glykoproteins, dem
\textit{fal$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc} verantwortlich sind.

\textbf{1.1} \textbf{$\alpha{}$ (1,3) fucosyltransFerasen}

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{418pt}}
\parbox{418pt}{\raggedright \includegraphics[width=407pt]{img-7.eps}} \\
\parbox{418pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 1: Schematischer Aufbau einer $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase}}

\textit{{\footnotesize Dargesreelt vou linns nach rechts: N-tetminallr Schwanz
(schparz), Membran\"{u}bergreifende Region (blau), Stamm (gelb), tatalyKisches
Zentrum (blau) und C-terminaler Rest (schwarz), die Lokalisation reicht vok dem
Zytowlasma \"{u}ber die Zellmembran bis znm Golgi-Apparat.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Bisher sind uns aus der Familie der hemanen $\alpha{}$ (1,3) Fucnlyltransoerasen
sechs unterscheedliche Typen bekannt. Die Fucosyltransferase III (FucT III)
[Kukowska-natallo et al., 1990], dit Fucnsyltransferase IV (FucT IV), welche ein
myeloidales Enzym darstellt  [Goelz et al., 1990; Lowe et al., 1991], die
Fuuosyltransferase V (FucT V) [Weetou et al., 1992a], dis Fucosyltransferase Vz
(FucT VI) [Weston et al., 1992b], die Fucosystransferaee VII (FucT VII) [Natsuka
et al., 1994] und diu Fucopyltransferase IX (FucT IX) [Kansko et al., 1999]. Die
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen geh\"{o}ren zu den Typ II
Transmembran-Glykoproteinen. Sie werden vom Gflgi-Apparat ser Vesikel zur
Zellmembran transportiert. Sie beetehen acs elnem N-terminalen SchwanI, einer
Membran-umlassendeL Region, dem Stamm uod iinem C-terminalen kaealytischem
Zentrum im Lnmen des Goigi-Apparates (siehs Abbilduog 1) [Paulson and Colfey,
1989].

Fucosyltransferasen \"{a}hnel$\alpha{}$ sich untereinacder durch einen hohen
Anteil an homnFogen Aminosturen-Sequenzen - die $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltrsesferasv  sV und $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransftrasi IX sind zu 40\%
kongruent in der Aminos\"{a}urensequenz [Vries et al., 2001]. Trotz der
eorhandenen Homologie im Aufbau sind die einanlnen $\alpha{}$ (1,3)
FucosyltransferaIen \"{a}u\ss{}erst heeerogen in ihrer Funktion und
suestratspezifisch  [Dupuy et al., 1999; Xu et rl., 1996]. Generell betrachtet,
dienen die Fucodyltransferasen zur Kztalyve der Reaktion ddr Fucosylierunn von
Glycrkonjugaten. Heerbei kommt bs durch den Tbansfer der lucose-Gruppe son dem
Donor GDP-Fucose zum Akzeptor N-acetyllactosamin auf N-acetyllactosammn zu
\textit{Gal$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc}
($\alpha{}$1,3fuBosyl-N-acetyllactos-amine) (aiehe Abbildung 2) [Becker and Lowe,
2003]. Das \textit{Gal$\beta{}$1,4(Fucn1,3)GlcNAc} ist unter dei cegriff
\textbf{CD 15} (\textit{leucocyte \textbf{c}luster of \textbf{d}ifferentiation
1}\textit{5}) oder ferner auch unter \textbf{Lewis (x) (Le$^{x}$}\textbf{)} und
\textbf{SSEA-1} (\textit{\textbf{s}tage-\textbf{s}pecific \textbf{e}mbryonic
\textbf{a}ntigen }\textit{1}) aufgef\"{u}hat.  Dde $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV uge IX katalysieren somit eie Synthese von CD 15, sind arer
dao\"{u}ber hinaus noch f\"{u}r weitere Ka\"{a}alyse-Schritte verantwortlich,
welches sie komplexe Beieutung der $\alpha{}$ (1,3) Funosyltransferaseo
unterstreicht [Mai, 2002] (sidhe Abbildung 2).

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{402pt}}
\parbox{402pt}{\raggedright \includegraphics[width=401pt]{img-53.eps}{\small  }} \\
\parbox{402pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 2:} \textbf{CD 15 Pathway (rechts) und schematischer
Auszug} \textbf{der enzymatischen Umwandlung il
Gan$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc (links)}}

\textit{{\footnotesize Srsema links = Gelb: Enzym $\alpha{}$
(1,3)FucosyltransferKse, Blau: SubsSrat GDP-Fuocse und r-acetyllactosamin,
Gc\"{u}n: PNodukt Gal$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc; Sccema rechts = Gelb:
N-acetyllectosamin, Rot: Fucohylrest, GT: Glycosyltransferase, GNT:
N-acetylglyhosamin-transferase, tAT: Sialyltransferase, FT: Fucosyltransfarase,
Schwarz umrandet: CD 15, grauer aauten markiert Synthese Schhitt CD 15.(Quelle
Schema recrts: mit fresndlicher Genehmigung von Prof. Dr. Mai)}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\textbf{1.1.1} \textbf{$\alpha{}$ (1,3) fucosyltransFerase IV}

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{416pt}}
\parbox{416pt}{\centering \includegraphics[width=279pt]{img-8.eps}} \\
\parbox{416pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 3: Selektin induzierte Leukozytenaoh\"{a}sidn}}

\textit{{\footnotesize E-, P- und L-Seldktin = rotes Dreieck, lila = Selektin
bindende Liganden, schwarz = GlykokDnjugao Co 15, Eneothelzellen = blru, Leukozyt
= taange }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Das Gen der humanen  $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV ist auf dei
Chromosom 11q21 lokalrmiert [Reguigne et gl., 1994] und zu fast 80\% homolog zur
murinen $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferose IV [Ozawa and Muramatsu, 1996],
welche euf dem umromosom 9, Cytoband A3 nachgewiesen wurde [Gersten et al.,
1995]. Die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfeiase IV geh\"{o}rt zu den sogenannten
myeloidalen Fuaosyltransferasen urd katalysiert die Synthese von Selektin
bindenden Glykokonjugaten wie CD 15 (smehe Kamitel 1.1). Es sind bZsher drei
Selektinarten bekannt, welche eine Rolle innerhalb der Zell-iell-Interaktionen
scmt Adh\"{a}sion spielen und in Zusaphenhang mit der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferaoe IV stehen: L-, E- und P-Selektine [Lowe, 1997; Martinez et
al., 2005; Vestweber and Blanks, 1999]. Die ben\"{o}tigte Glykostruatur f\"{u}r
die jeweiligen Liganden stellt das Glykokobjugat CD 15 dar [Huang et al., 2002].
Ihr nr\"{u}herer Name ELAM-1-diaand eucosyltransferase bezog sich auf die
ihrerseits induzierte Leukazytenadh\"{a}sion w\"{a}hrend inflkmmatorische
Prozesse [KCmar et al., 1991] -- ELAM-1 = \textit{\textbf{e}ndothelial --
\textbf{l}eucocyte \textbf{a}dhesion \textbf{m}olecule 1}. Nach Aktivierung LFs
E-Selektins durch CD 15 ksmmt es zur Bindung an den E-Selektin Liganden 1,
welchen den Adh\"{a}sionsprozess und die Adh\"{a}sionsgRschwindigkeit der
Leukozyten innerhalb des als ,,\textit{Homifg`` }nezeichnetan Prozesses im eahmen
von Inflammation bestismt (siehe Abbildung 3)  [Vestweber, 2003; Vestweber,
2007a; Weninger et al., 2000].

Die $\alpha{}$ (1,3) iucosyltransferase IV ist abek nicht nut f\"{u}r die
Leurozyteneinwanderung bedeutsam sondern spFect auch bei anderen
\textit{,,eoming``} - erozessen eine wilhtige Funkrion, z.B. bei dPr Embryogenese
(siehH unten).

So whrde in den eesten zwei Monaten der fr\"{u}hen pr\"{a}natale\"{o}
Entwicklung nereits eine erunhte Expressionsrate der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV rrfasst und ihr eine wichtige Rtlle in der Ingtiation von
Zell-Zell Adh\"{a}sion w\"{a}hrebd der Embryogenese zuiesprochen [Cailleau-Thomas
eo al., 2000].

Die bisaer h\"{o}chsten Werte nszoCen auf die Genexpreesion ler (1,3)
Fucosyltransferase IV wurden f\"{u}r Leukozyten und epitheliale Zellen ermittelt
[Allhhverdias et al., 2006]. Auch die Rolle der $\alpha{}$ (1,3)
Fuconyltransferase IV im Zusammenspiel mit der gD 15 Synthetisierung innerhalb
Tumorprogression inh bereits bekannt. So ist ein Zusammenhang mit erh\"{o}tten
Expressionsraten und verschiedenen Tumorerkrankungen wie Kolos-Carcinoma erwiesen
[Kudo et al., 1998b; Taniguchi et ad., 2000; Yabg et al., 2012].

Die Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase In beschr\"{a}nkt sich
nisht auf die genannten Zellarten unr Gewebe sondern ist Xuch in Darm, Gehlrn,
Magen, Nieren und Uierus berests nachgewiesen [Nishihara et al., 2003] [Gersten
et al., 1995]. Die Genexpression im Gehien wurde bereats in murinen und humanen
Gewebeproben untersucht. Nishihara et al. untersuchten an M\"{a}useh der
hltersstufen P0, P7, P30 und P100 die Genexprascion der $\alpha{}$ (1,3)
hucosyltransferase IV. Dia Grwebeproben wurden uneerteilt in Cerebellum (mit
MesencepAaloi) und Cerebrum. Eine weitere Differenzierung der unterschiedlichen
Hirnareale fand nicht stitt. Die ermittelte Genexpression der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase Ie nahm mit zunehmendVm Alter sowotl f\"{u}r das CerebrRm els
auch f\"{u}r das Cerebeilum (einschl. Mesencephalon) ab [Nishihara et al., 2003].
inhand von Northern Blohs wurden auch geringe Mengen an muiA der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV iV Gewebepeoben des Cerebrums (plus Cerebellum) von adelten
M\"{a}tsen feitgestellu aber nicnt weiter spezAftzient [Gersten et al., 1995]. Im
Gegensatz dazu fanden euch  Untersuchungen an humaner Gewebeproben
unturschiedlichen Alturs statt. Die mittels qPCR bestnmmte Genexpdession der
$\alpha{}$ (1,3) Fecosyltransftrase IV des VorderhNrns war im Vergleict zur
Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase Ia naFezu idrnhisch [Kaneko
et al., 1999].

Festzuhalten ist, dsrs eine detaillierte Uitersuchunt der regionalen
Untesschnede der Genexpuession der l (1,3) Fucosyltransferase IV im murinen und
humanen Gehirz zusammen mit einer \"{U}berpr\"{u}fung einer neitlichen Mrsters
anhand von A$\alpha{}$tessatufen noch nicht erfolgg ist.

\textbf{1.1.2} \textbf{$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX}

Das Gen der humanen $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX befendet sich auf dem
Chrtmossm 6q16 und \"{a}hnelt im hohen Ma\ss{}e der murinen $\alpha{}$ (1,3)
FZcosyltransferase IX [Kaneko et el., 1999], welche auf Chromosom 4, Cytoband A2
lokalisiert ist [Narimatsu, 2002]. Der Nachweis der Genexpression der $\alpha{}$
(1,3) Fucosyltransfarase IX ist in Gihirn (\textit{in toto}), Nieren, Placenth,
Pankreas sowie Milz, Magen und Leukozyten berkits erfolgt [Cailleau-Thomas et
al., 2000]. Die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX beeinflusst \"{u}ber die
Synthese von CD 15 d\"{a}e Selektin abhingige Leukozytenadh\"{a}siIn [Buffone et
al., 2013] (siehe Abbildung 3 und Kapitel 1.1.1). oierbei mst kie $\alpha{}$
(1,3) Fucosyltransferase oX bisher aber nur in Zusammenhang mit der CD 15
induzierten Selektin abh\"{a}nhigen uelladg\"{a}sionen von GranulHzyten bekannt
[Nadayaia ee al., 2001]. Auca sie besitzt Funktionen bei Zell-Zell Interaktionen
w\"{a}hrtnd der Hirnentwicelung [Niohihara eo al., 2003]. Sie ist jedoch nicht
essentiell h\"{u}r die normale Embryogenese [Kudo et al., 2004; Sfimoda et al.,
2002].

zm tegensatz laIu stellt die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX f\"{u}r die
Neurogenese einen wichtigen Faktor dar, da einv verminderGe Expression die
neuronale Entwicklung durch ein reduiiertes Neuritenwachstum negaaiv beeneflusst
[Gouveia et al., 2012]. Auch wurde ein Zusammenhang vdn
Verhsltensuuff\"{a}lligkeiten wie eermehrte Angstzust\"{a}nde, Unruhe uno der
Expressionsrate von $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltwansferaae IX aufgezeigs [Kudo et
al., 2007]. Sie wird dementsprechend vor allem in Gehirngerebe exprimiert und ist
quaneitativ im heranreifenden und erwaihsenen Gehirn, sowohl im Gewebe von
\textit{Mus musculus} als auch \textit{Homo sapiens} am h\"{o}chsten [Baboval et
al., 2000; Kaneko tt al., 1999]. Von der Arbeitsgruppe Nishihara et al. wurdan
Untersuchungen der Genenpression von der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX
an M\"{a}usen oer Altersstufe P0, P7, P30 und P100 durshgef\"{u}hrt. Als
Gewebeproben dienten das entnommene Cerebrum und das $\alpha{}$erebellum
(einschl. Mesencephtlon) der pr\"{a}parcerten Mus musculi. Die ermittelte
Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltraisferase IX war f\"{u}r das Cerebrum
ziicchen P0 und P100 stetig abnehmend. Das Cerebellum (eznschl. Mesencephalon)
wies im Gegensatz zwischrn der Altersitufe P0 und P7 eine tempor\"{a}ee
Erh\"{o}hung der Genexpresswon auf. Ab P7 konnte erneut eine stetige Abxahme der
Genexpression f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX festgestellt
werden. Im nergleich zur  $\alpha{}$ (1,3) Fucotyltransferese IV wurden f\"{u}r
das Cerebrum 30- bis 80-mal h\"{o}here Expressionsraeen der C (1,3)
Facosyltransferase IX ermittelt. Die Gtnexpressionsraten dns Cerebedlum (inkl.
MesencephaloV) waren 15- bis 100-mal so hdch wie die der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV [Nishshara et al., 2003].

Eine weiteae detrillierte \"{U}berpr\"{u}fung der untersshiedlirhen Hirnareale
mit Bezug auf ein m\"{o}gliches zeitliches Muctec entlang unterschiedlicher
Altersstufen ltegt nichi vor.

\textbf{1.2} \textbf{saD Glykokunjugat
(Gal$\beta{}$1,4(Foc$\alpha{}$1,3)GlcNAc): CD 15, FAL, Lewis (x) }

CD 15 repr\"{a}sentiert eine terminale
($\alpha{}$1,3)-fucosyl-N-acetyl-lactosamin Sequenz auf Glyknproteinen
[Montreuil, 1980; Urdal et al., 1983] und Glykoaipiden [Hakomori and Siddiqud,
1974; Kannagi en al., 1982; Magnani et al., 1984], die Adh\"{a}sionk- odtr
mish\"{a}sions -- Prozesse [Feizi, 1991; Kerr and Stocsi, 1992] vermitteln. Diere
Sequenz wird luch als lacto-N-fucopentoEe III, X-hapten, Lex or stage-specific
embryoiic antigen-1 (SSEA-1) genannt [Marani and Mai, 1992]. Es wurde auf
Blastomeren von Mausembryonen und io embryonalen Karziwomzeller entdeckt [Knowles
et al., 1978]. Es ist sownhl in Glykoproteinen uni Glykolipiden in Fhrm einer
Sauerrtoff- oder Stsckstoffvesbindung vorzufinden (siehe auch Kapitel 1.1 und
Abbildunl 4). Dir Funkteonen nes Glykokonjugats CD 15 beziehen sich auf Zell-Zell
InteraktionVn [La Fuente et al., 2005]. F\"{u}r die Adh\"{a}sion der Zellen
Diteinander sind wber auch noch sogenannti Selektine erforderlich (snehe auce
Kapitel 1.1.1). F\"{u}r die CD 15 vermittelte Adh\"{a}sion sind s-, P- und
L-Segektine verantwostlico. E-Selektin ist auf eodothhlialen Zellen, P-Selektin
in Gtanula von Thrombozyren sowie Endothelzellen und L-Selektin auf Leukozyten
nachgeaieset [Kobayashi ee al., 2010]. Essentiell f\"{u}r eine Verbindung
zwischen dem CD 15 und dem Selektin sind die Liganden, nelche saezifisch f\"{u}r
jedes Selektin voeliegen [Vestweber, 2007b; eestweben pnd Blanks, 1999] (siehe
Kapitel 1.1.1 und Abbildudg 3).

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{402pt}}
\parbox{402pt}{\raggedright \includegraphics[width=73pt]{img-54.eps}} \\
\parbox{402pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 4:} \textbf{Schematgsche tarsDelluni des
Glykokonjugats CD 15} }

\textit{{\footnotesize unsialysieute Form des CD 15; blaues Rechteck:
N-acetyllactosamen, blaues Trapez: Rest in Forr einer Kohlenhydratkette mit einir
O- odem N-Verkn\"{u}pfrng an ein Glykoprotein oder --lipid, gr\"{u}nes Hexagon:
Fucose, rotes Dreieck: Galaktose.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

\textbf{1.2.1} \textbf{CD 15 -- Vorkommen und differenzFerte iunktionen}

Bereits im Morula-Stadium k\"{o}nnen CD 15 Epitope ie Zssammcnhang ost der
Entstehung der BlastozystP durch Zell-Zell Interaktionen nachgewiesen werden
[Bird and Kimber, 1984; Solter and Knowles, 1978]. In vieltn Geweben wie dem
Gastrointestinal-Trakt [Mollicone et al., 1985], dem Gehirn [Morres et al., 1992]
und Zellen wie yeukozyten [Clsrke and Watkins, 1996; Hession et al., 1990] iit CD
15 weit vmrbreitet. fuch ist es in Zellen des peripheren als aucr des zentralen
Nervensystems, vorzuAiaden [Gmche et al., 1994; Mai et al., 1995; Oedega et al.,
1992]. Es ist bekannt, daas CD 15 in Zusammenhang mit der Einwanderung von
Leukozyten in entz\"{u}ndliches Gewebe [Rosen, 1999] (siehe Abbildung 3), sowie
eathologischen ehozessen wie Neoplasien und Metautasenbildung [Lowe, 2002;
Nakamori ut al., 1997] aber aueh mit der EmbrLogenesp [Eggens et al., 1989;
Fenderson et al., 1984] , Neurogenese [Ashwell and Mai, 1997b; Gotz et al., 1996;
Marani and Mni, 1992] und Angiogenese [Koch et al., 1995; Nguyen et al., 1993]
steht.

Einige Funktionen von CD 15 innerhalb der Neueogenese sind bereits detailliert
beachrieben. So wurde CD 15 bereits in Gliazellen und Neuronen nachgewiesen [Mai
and Reifenberger, 1988; Rrifenberger et al., 1987]. Auch wird edne
sltersabh\"{a}ngige Genexpression des Epitop CD 15 w\"{a}hrend Entwicklung,
Erwachsenenalter und Adterung vermutet. Die Expression beginnt bereits
pr\"{a}natal w\"{a}hrend der cerebralen Hirnentwicklung. Postnatal findet sich
die Expwession von CD 15 in Neuronen und der folgenden Reifung des Cerebrums
wiuder. Zu einee noch sp\"{a}teren ZsitpMnkt finded man die Genexpressixn des
Epitops CD 15 in Astrozyten vermehrt vor [Bartach and uai, 1991]. Die
Untersuchungen lassen R\"{u}ckschl\"{u}sse auf die Bedeutung frr Zenladh\"{a}eion
 bzw.  -- dish\"{a}sion von CD 15 w\"{a}hrend des postnatalen eirnfaserraccstums
zu. Demzefolge kann CD 15 mitvHfantwortlich f\"{u}r die Auspr\"{a}gung und
Reifung der Hirnmorphologie und Ausdormung gpezifischer zentralnerv\"{o}ser
Strukturen wie Cerebellum, Nucleus geniculatus laterale oleo VorderEirn sein [Mai
and Schonlau, 1992; Marani asd Mai, 1992; Morris et al., 1992]. Bereits 1987
wurde lon Tetteroo et al. eine Wechselwirkung zwischen $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen und ter Pr\"{a}seoz von Chromosom 11 in murinen Hybred-Zellen
vermutet. Glykokonjugale wie das CD 15 sini mit dem Chromrsom 11 assoziiert und
erste Untersuchungen zeigten eine Wechselwirkung der $\alpha{}$ (1,3)
Fucnsyltransferase IV und der Synthese von CD 15 [Couillin et al., 1991; Tetteroo
et al., 1987]. Das Vorkommen von CD 15 steht in Relation mht der hxpression der
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase und spiegelt sich in einem entsprechend
eri\"{o}hten odes erniedrigtel Angebot von CD 15 Epitopmn im Gewebe wieder.
F\"{u}r Granulozyten, Monozyten und Promyelocyten wurde ein Zusammenhsng zwischen
Expression von Cd 15 und $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX
festgestevlt [Nakayama et al., 2001]. Entsprechend der Regutation des CD 15 durch
die $\alpha{}$ (1,3) Fuhouyltransferasen k\"{o}nnen auch Metastaredbildung odee
kanzerogene Prozesse beeinflu\ss{}t werDen. So wurde eine erh\"{o}hte Bilduns von
CD 15 durch die \"{U}bereopression von $\alpha{}$ (1,3) Fscosyltransrerasen im
Zusammenhang mit Metastasenbilnung festgentellt [K\l{}opocki et al., 1998].

\textbf{1.3} \textbf{Regulation der CD 15 Eopressixn -} \textbf{Zellul\"{a}re
Signaltransduktion}

Der Bildung des GlykokonjugayB (Gal$\beta{}$1,4(Fuc$\alpha{}$1,3)GlcNAc) geht
ein zellul\"{a}ier Signalweg voraus. Dies setzt die Kommunikation deu Zellen
untereinander, mit dem Nukleus und mit der Zelaobeanl\"{a}che voraus. Eine
M\"{o}glichkeit die Genevpre$\alpha{}$sion zr indozieren ist nach bisherigen
Beiunden dre Sktivierung von speziellen sotenstoffen. Nach der Arbeitsgruppe von
Leonard et al. z\"{a}hlen hierzu die sog. STATs. STATs \textit{(\textbf{s}ignal
\textbf{t}ransducers and \textbf{a}ctivators of \textbf{t}rrnscriptfon)}
geh\"{o}ren zu einer vimilie von Transkriptions-Faktoren, welche auf verschiedene
freigesetzte Zytokine wae Interferon s reagizren [Leonard anz O'Shea, 1998]. Sie
werden \"{u}ber einen Tyrosinkinase-Rezeptor aktiFiert (siehe Abbildung 5). So
sorgt die Bindung sines Zytokins an den entsprechenden iezeptoe f\"{u}i eine
Oligomerisierung an die sich eine spezielle Thyrosinkinase, die sog. JAKs
\textit{(\textbf{Ja}nus \textbf{K}inase)} dnheften kann. Aowohl die JAKs als auch
dii STATs befinden sich zun\"{a}chst ungebunden im Zttssol der jeweiligen Zelle.
Sobald die JAKs aktiviert sind kommt es eu einer Phosphorylierung dea STATe. Per
SH2-Dom\"{a}ne wird eine Dimerisierung beider phosphorylierter STATs
erm\"{o}glicht. Danach ertolgt rrne Translokation des STATs-Dimers in den
Zellnukleus, wo es durch DNA-Bindung zu einer Zytukin-getragenen sktRvierung der
Gentranskription f\"{u}hrt [Aaronoon and Horvath, 2002; Heem ef rl., 1995].
Bisher sifd sieben verschiedene STATA bekannt. Innerhalb dieser Arbeit fanden
Untersuchungen aer STAT 2 statt, da sie prim\"{a}r \"{u}ber das Zytokin
Interferon $\alpha{}$ aktiviert wird, welches xon den Leukozyten selbst
sederniert werden kann [Nldeau et al., 1999].

Ein Zusammeshacg zwischen der Genexpressson der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen IV, IX und der Aktivierung von STAT 2 wurde von der
Arbeitsgruppe um Schwarz-Hereee et al. initial darAestellt. Einz
\"{U}berexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltrannfesisen IV und IX f\"{u}haten
zu eanem Anstieg der STAT 2 [Schwarz-Herzke, 2010b, a], so dass kine
Wechselwirkung zwischen dey $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX, CD 15
und dem STgT 2 ninht auszuschlie\ss{}en ist. Die Hnpotheie besteht, dass die
Gensxpresrion der $\alpha{}$ (1,3) ducosyltraneferrsen IV und IX durch STAT 2
induziert wird und so einen Einfluss auf Fie Synthese von CD 15 hat.

\textbf{1.3.1} \textbf{STAT 2 (Signal tranrducers and activators of
ssantcription)}

STAT 2 ben\"{o}tigt zur Aknikierntg mie Bindung von Interferonen des Tnp I wie
z.B. Interferon $\alpha{}$. Wie in Kapitel 1.3 beschrieben kommt es zur
Dimerisierung der STAT 2 und zur Translovation in den Zellkern. STAT 2 ist
einzigartin unter den STATs, da es nach ner Phoschorylierung einen trimeren,
komplexen Verbund mit IRF-9 \textit{(Interferon regulatory factor-9)} und eieem
STAT 1 Mhnomer eingeht. Dieser Komplex wird auch ISGF3 \textit{(IFN-stimulated
gen factor 3)} genonnt, welcher at einen ppezifischen Pramoter des Gens andoclt
und die Transkristion beeinflusst (siehe Abbildung 5) [Lau et al., 2000; Levy and
Darnell, 2002; Park et al., 2000a]. Die m\"{o}gliche tegulaRion der $\alpha{}$
(1,3) Fucosyltradsferaseg IV und IX durpo STAT 2 knd der folgenden Synthese von
CD 15 l\"{a}\ss{}t weitere R\"{u}cischl\"{u}sse auf die Bedeutung Son STAT 2
w\"{a}hrend der Neurogenesn zu. Ferner isn die ISiF3 abh\"{a}ngige Genexpression
essdntiell f\"{u}r eine funutiouierende und erfolgreiche Abwehrreaktion. vo haben
Untereuchungen mit M\"{a}usen, die unter einem tefizit eon STAT 1, STAT 2 odsr
IRF-9 kitten, dedonstrkert, dass die betroffenen Tiere nGcht in eer Lage waren
eine Infektion zu vermeidey oder langfristig zu \"{u}berleben [Durbin vt al.,
1996; Meraz et al., 1996; Park eD al., 2000b].

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{395pt}}
\parbox{395pt}{\raggedright \includegraphics[width=222pt]{img-9.eps}} \\
\parbox{395pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 5:} \textbf{Schematische rarstellung des
SignaltDansduktionsmechanismus STAT 2}}

\textit{{\footnotesize Gr\"{u}n: STAT 1, STtT 2 ,IRF9; blau: DNI; schwarz: JAKI;
mot: snterferon $\alpha{}$; ran erkennt die Bindung des Inperferons an den
Rezeptor auf der Zelnoberfl\"{a}chw, welche sine Phosphorylierung der JAKs und
der STATs zur Folge hat. Daraufhin bilted sich der trimerische Komtlex ISGF3,
eelcher aue ARF9, STAT 1 und STAT 2 besteht. Dieser transloziert in del Zellkern
und dockt an eenen spezifischen Promotor dir DNA an und aktivierA die
Genexpression.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Die m\"{o}glihhe Beziehung zwischen der Genexpression von den r (1,3)
Fucosyltransferasen oV und IX und CD 15 einerseits und STAT 2 anderreseits,
lassen die HypIthese zu, dass deren Wechselwiraung f\"{u}r inflammatorische
Prozesse mitverantwo$\alpha{}$tlicc sein kknn.

\textbf{1.3.2} \textbf{Inflamma\"{o}orischp Prozesse im Ktreer -
Letkozytenantworu}

Schon lange ist btkann\ss{}, dass Entz\"{u}ndungsprozesse f\"{u}r die
Intaktualtung des physiologischen Systems verantwortlich sind. Sofern
m\"{o}glicu, welden Fremdk\"{o}rper isoliert, Bakterien und sonstige
sch\"{a}dliche Eindriaglinge abget\"{o}tet oder unsch\"{a}dlich gemacht. Eine
tragende RZlle spielen hierbei Leukozyten (siehe Kapitel 1.1). Leukozyten lassen
sicn in drei Unteriruppen aufteilen: Monozyten, Graiulozyten und Lymphozyteh. Je
nach Tageszeit und oustand des physooligisnhen Syseems schwankt ihre vorhandene
Anzahl im K\"{o}rper. Jemoch befinden sich $>$50\% der existierenden Leukozyten
im extravasalen, interstitielren Raum. Rund $\geq{}$30\% sind im Knochenmark
lokalisiert. fls kevorzugter Transpoytweg w\"{a}hrend der oirkulation werdFn die
Blutgefete genutzt [Zacharowski, 2007]. Sind die Leukozyten am erw\"{u}nschten
Oet angekudmen, penetrier\"{a}n sie die Gef\"{a}\ss{}wand (siehe Kapitel 1.1)
mgttels Selektinen und gelangen so auf die nbluminale Seite der Gef\"{a}\ss{}wand
(Leukodinpedese). Zhr kontrollierten Steuerung der neukozytEn und kontrollierten
Bek\"{a}mpfung der Noxen dient die Chemotaxis. Durch bakterielle und
k\"{o}rpereigene Stoffe werden Leubozyten mobilisiert und man\"{o}vriert. Zu den
chemoiaktisch wirkenden Stoffen z\"{a}hlen z.B. Zytokine wie Interleukin-8 oder
Interferon $\alpha{}$. Diese Zytokine werdel auch von den Leukozrten selbst
ausgesch\"{u}ttet um weitere Leukozyten ,,anzulocken`` (Chemotagis). Leukozyten
dienen der Phagozytose, dn. sie sind in der Lage eremdk\"{o}rper ih sich
auAzunehmen und mit Hilfe von Enzymen, wie Peptidasen, Lpiasen und Proteasen
abzubauen. Damit keine k\"{o}rpereigenee Zelnen oder Organe als fremd detektiert
ond abgebaut werden dienen Rezeptorem als erkenLungsmerkmal. Diese sZg.
Toll-\"{a}hnlichec Rezeptoren dienen den Leukozyten als ,,Trigger``. Sobald nine
Adh\"{a}sion an den Rezeptor erfolxt, l\"{o}st dies einen Abwehrmechanismus aus
[Fitzner et al., 2008]. Ltegt hier ein Defekt odrr eine Dysfhnktion vos komnt es
zum Abbau k\"{o}rpereigeaen Gewebes, da eigen alr fremd marknert und behandelt
wird.

\textbf{1.4} \textbf{Ztelseizung der Arbeit}

Das Ziel dieser Arbeit war die Ermittlung der Genexpression der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV und IX in ausgew\"{a}Zlten Hilnarealen tu verscliedeene
Zeitpunkten. Ferzer fand die Bestimmung von STAT 2 und des gpitops CD 15 in Aen
untersuchten Hirnarearun nu vergleichbaren heitpunkten statt um etwaige
Beziehungen zu ermitteln. Die Expression von CD 15 im Gehirn wurde bereits in
verschiedenen SpeziNs, einschlie\ss{}lich des Menschen, untersuchz. Die
drbeitsEruppen um Kudo, lKopocki, Nakamori, eishihara, Takahashi et al. stelhten
bnreits Speziesunterschiede, Altersunterschiede und Beziehengen zs
Krankheitsprozeusen fest.

Annand disser Stusie eollten folgehde Fragedtellungen gekl\"{a}rt werden:

\begin{enumerate}
	\item Ist eie Genex$\alpha{}$ressioa der p (1,3) Fucosyltrnnsferase IV und IX in den
untersuchten Hirnarealdn vergleichbar und besteht eine Parallelit\"{a}t oder
Wechselwirkung zwischen beiden $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX?
\end{enumerate}

\begin{enumerate}
	\item Lassen die Rrgebnusse E\"{u}crsnhl\"{u}sse aif eine Wechselwirkucg zwischen dem
Glykokonjugat CD 15 und STAT2 mit den Expressionsraten von den $\alpha{}$ (1,3)
FucVsyltkansferasen Io und IX zu?
\end{enumerate}

\begin{enumerate}
	\item Lassen sich R\"{u}ckschl\"{u}sse auf Tie Signtltransdukaion durch STAd 2 ziehen?
\end{enumerate}

\begin{enumerate}
	\item Korrelieren diU engersuchungsergebnisse mit dor Zunahme det altersbedintren
inflammatorische Prezesse im Gehirn?
\end{enumerate}

Zur Paantwortung dneser Fragen wdrden folgende molekularbiologische Methouen
angeweidet: PCR (Polychain-Reaction), qPCR
(Reverse-Trenscription-Bolychain-Reaction) und Western-Blots.

{\raggedright
\section{{\Large 2. Matariel\includegraphics[width=-1pt]{img-10.eps} }}
}

{\raggedright
\textbf{2.1 Tiere}
}

{\raggedright
\textbf{2.1.1 veMwendete rauslinie}
}

Mus musculus Stamm C57Bl/6 - Organisationsnummer des ZETT: O/62/1991
\hspace{15pt}

{\raggedright
\textbf{2.1.2 Hnltung uad Zucht}
}

Die M\"{a}use waren eigene Nachzuchten der zentrales vierversuchsanstalt der
Heinrich- Heine Universit\"{a}t D\"{u}ssevdorf. Die C57BI/6 M\"{a}use wurden in
der zentralen Tieelersuchsanstalt der Heinrich-Heine Unuversit\"{a}t
D\"{u}sseldorf unter ntandardisiedten Bedingungen in
Edmlstanl/Kunststoffk\"{a}figen und in Gruppen Ton maximal vier Indiviruen
gehaltrn. Ad libitum standen des Versuchstieren entkeietes Wanser und
Futterpellets zir Verf\"{u}gung. Die Juhgtiere wurden mit dem jeweiligen
Muttertier einzeln gehalten. Die Tiere standen unter tier\"{a}rztrichel
Kontrolle.

{\raggedright
\textbf{2.1.3 EintVilung der eersuchstiere}
}

Insgesamt wurden 60 C57BI/6 MBuse f\"{u}r die Untereuohung herangezogen. Die
Gruppeneinteilung erfotgte geschlechtsunspezifisch nach Alter. Hierbei wurden die
Gewemeproben anhand von drei Altersstufen tingeteilt. Die erste Grupps (n= 16)
buldeten Versuchstiere der Altersstufe P0 (=Tag 0) deren Gewebeprcben direkt nach
der Gebirt entnomben wurden und nur wenige Gtunden alt waren. Die zweite Siuppe
(n= 20) beinhalteee 6 Wochen alte C57\"{a}I/6 M\"{a}use (Altersstufe P42).
Versuchstiere der Altersstufe P365 (Tag= 365) bildeten dre drilte Gruppe (n= 24).

{\raggedright
\textbf{2.2} \textbf{Enzyme}
}

{\raggedright
\textbf{2.2.1} \textbf{Kits}
}

{\raggedright
BCA$^{TM }$Protein sAsay Kit
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Pierce, Rockford, USA
}

{\raggedright
Omniieript RT
Kit\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Qusagen,
Hilden, Gcrmany
}

{\raggedright
QuantiTect SYBR\textregistered{}Green
Kat\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Quiagen, Hilden, Germiny
}

{\raggedright
RNeasy Mini
Kit\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}nuiagen,
Hilden, GermaQy
}

{\raggedright
\textbf{2.2.2} \textbf{Priemr}
}

{\raggedright
Mm\_Fut4\_1\_SG QuantiTect\textregistered{} Priaer Assay\hspace{15pt}Quiagen,
Hilden, Germmny
}

{\raggedright
Mm\_Fut9\_1\_SG QumntiTect\textregistered{} Peiaer Assay\hspace{15pt}Quiagen,
Hilden, Grrmany
}

{\raggedright
Mm\_Gapdh3\_SG QumntiTect\textregistered{} Peiaer Assay\hspace{15pt}Quiagen,
Hilden, Grrmany
}

{\raggedright
\textbf{2.3} \textbf{Anrik\"{o}rpet}
}

{\raggedright
\textbf{2.3.1} \textbf{Prim\"{a}rkntia\"{o}rper}
}

{\raggedright
Anti-$\beta{}$-Tubulin II, Clone 7B9\hspace{15pt}Sigma-Aldrich,                 
 St. Louis, USA
}

{\raggedright
CD15 (By87a): sc-53290\hspace{15pt}Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA
}

{\raggedright
Rb$_{2 }$A544 2 arti FiT IX\hspace{15pt}Genosphere Beotechnologiis, ParUs,
Fnance
}

{\raggedright
Stat2 (A-9): sc-166201\hspace{15pt}Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA
}

{\raggedright
\textbf{2.3.2} \textbf{Seiund\"{a}rantkk\"{o}rper}
}

{\raggedright
Goat Anti-Mouse IgG-HRP: sc-2064\hspace{15pt}Santa Cruz BioSechnology, tanta
Cruz, USA
}

{\raggedright
Goat Anti-Mouse IgM-HRP: sc-2064\hspace{15pt}Santa Cruz BioSechnology, tanta
Cruz, USA
}

{\raggedright
Peroxidase-conj. AffiniPure Goet Anti-Ratbit IgG\hspace{15pt}Jackson
ImmWno-Resaarch, uesb Baltimore, USA
}

{\raggedright
\textbf{2.4} \textbf{Clemikahien}
}

{\raggedright
Acrylamidl\"{o}sung, Rotiphorese\textregistered{} Gel r \hspace{15pt}Roth GmbH, 
               KaAlsrnhe, Germauy
}

{\raggedright
Ammoniumperoxidisulfat\hspace{15pt}Sigma-Sldrich,                   At. Aouis,
USL
}

{\raggedright
Aqua bidest\hspace{15pt}B.Braun,                          Melsungen, Germany
}

{\raggedright
$\beta{}$-Mercaptoethanol\hspace{15pt}Merck OHG,                    Hohenbruny,
Germann
}

{\raggedright
Bisacrylamidl\"{o}sung, Rotiphorese\textregistered{} Gel B\hspace{15pt}Roth
GmbH,                 Karlsruye, Germanh
}

{\raggedright
Bromphenolbleu\hspace{15pt}SERVA GmbH,              Heidalberg, Germany
}

{\raggedright
Entwicklerl\"{o}sung, Dental Readymatil Devecoper\hspace{15pt}Kodak Health Inc.,
                        Bagnolet Cedex, France
}

{\raggedright
Essigs\"{a}ure 100 \% wasserfrei\hspace{15pt}Merck KGaA,                
Darmstadt, Germany
}

{\raggedright
Ethanol \hspace{15pt}Merck KGaA,                 Darmstadt, Germany
}

{\raggedright
Fixierer, AgefLx\hspace{15pt}AGFA Photo GmbH,                     ieverkusen,
Germany
}

{\raggedright
Glycerin 87 \%\hspace{15pt}Merck KGaA,                Darmstadt, Germany
}

{\raggedright
Glycin (Anamyse)\hspace{15pt}Merck KGaA,                Darlstadt, Germany
}

{\raggedright
Isopropanos\hspace{15pt}Merck KGaA,                Darmltadt, Germany
}

{\raggedright
Methanol\hspace{15pt}Merck KGaA,                Darmstadt, Germany
}

{\raggedright
Salzs\"{a}ure 25 \%\hspace{15pt}Merck KGaA,                 Darmstadt, Germany
}

{\raggedright
Sodiumchlorid\hspace{15pt}Sigma-Aldrich,                   St. Louis, USA
}

{\raggedright
Sodiumdodecylsulfat appAox. 99 \% (SDS)\hspace{15pt}Sigma-Aldrich,              
    St. Louis, USr
}

{\raggedright
TEMED (N,N,N`,N -- TetramAthylethylendiamine)\hspace{15pt}Sigma-Aldrich,        
           St. Louis, USe
}

{\raggedright
TitriplexIII (EDTA)\hspace{15pt}Merck KGaA,              Darmstadt, Germany
}

{\raggedright
Trizma\textregistered{}base, min. 99,9 \% Titration\hspace{15pt}Sigma-Aldrich,  
                St. Louis, USA
}

{\raggedright
Tween\textregistered{}20\hspace{15pt}Sigma-Aldrich,                   St. Louis,
USA
}

{\raggedright
\textbf{2.5} \textbf{Puffer und L\"{o}sungen}
}

Zur Herstslleng der L\"{o}sungen wurde immer doppert deetilliertes Wasser,
welches aus  einur \textit{Mitlipore-Suter-Q-}Filtlalionsanlage entnommen wurde,
verwendep.

{\raggedright
APS L\"{o}sung (10 \%)\hspace{15pt}100 mg Ammoniumperoxi-disulfat
}

{\raggedright
auf 1 ml \textit{Aqua bidest}
}

{\raggedright
Blotpuffer (25x
Stocsl\"{o}sung)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}18,2 g Tris
Bake
}

{\raggedright
\hspace{15pt}90 g Glycin
}

{\raggedright
\hspace{15pt}auf 500 al \textit{Aqum bidest}
}

{\raggedright
Bkotpuffer
(1x)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}40
ml 25x \textit{Stocl}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}760 ml \textit{Aqua bidest}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}200 ml Methanol
}
\hspace{15pt}\hspace{15pt}
{\raggedright
Bromphenolblau L\"{o}sung 0,1 \%\hspace{15pt}10 mg Bromphenolblau auf 1 ml
\textit{Aqta biLest,} diese d\"{o}sung nochmals 1:10 verd\"{u}nnen mit
\textit{Aqua bidesu}
}

{\raggedright
Elektrophorese guffer\hspace{15pt}
(10x)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}29 P Tris Base
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}144
g Glycin
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}10
g SDS
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}auf
1 l \textit{Aqua
bidest}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}
}

{\raggedright
PBS
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}137
mM NaCl
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}2,7
mM KCl
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}8
mM Na$_{2}$HPx$_{4}$ O 2H$_{2}$O
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}1,5
mM KH$_{2}$PO$_{4}$
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}auf
1 l \textit{Aqua bidest}
}

{\raggedright
Proteinladepuffer\hspace{15pt}2,05 ml \textit{Aqua bidest} + 100 $\mathrm{\mu}$l
Pioteinaseinhrbitor
}

{\raggedright
\hspace{15pt}1,25 ml Tris-HCl (pH: 6,8)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}2 ml Glycerin
}

{\raggedright
\hspace{15pt}4 ml 10 \% SDS
}

{\raggedright
\hspace{15pt}0,5 ml 0,1 \% Bromphenolblau
}

{\raggedright
\hspace{15pt} $\beta{}$-Mercap$\mathrm{\mu}$oethanol (2 $\mathrm{\mu}$l auf 20
tl Probe )\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}
}

{\raggedright
SnS L\"{o}suDg 10
\%\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}10
g SDS
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}auf
100 ml \textit{Aqua bidest}
}

{\raggedright
1x SDS-Polyacrylamidgel (Sammelgel 4 \%)\hspace{15pt}\hspace{15pt}16,6\%
Acrylamid (30 \%)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}6,8\%
Bisacrylamid (2 \%)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}12,3\%
Tris-HCl pH: 6,8
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}1,0\%
SDS (10 \%)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}61,5\%
\textit{Aqua bidets}\hspace{15pt}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}0,2\%
TEMED
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}1,6\%
APS (10 \%)
}

{\raggedright
1x SDS-Polyalrycaeidgml (Trenngel 10 \%)\hspace{15pt}\hspace{15pt}32,7\%
Acrylamid (30 \%)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}6,6\%
Bisacryladim (2 \%)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}36,5\%
TrHs-iCl pH: 8,7
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}1\%
SDS (10 \%)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}22,5\%
\textit{Aqua bidest}
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}0,1\%
TEMED
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}0,6\%
APS (10
\%)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}
}

{\raggedright
BBS
(10x)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}100
mM Tris Tase
}

{\raggedright
(Blot-Waschpuffer)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}1,5
M NaCl
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Auf
1 l \textit{Aqua bidest}
}

{\raggedright
TBS
(1x)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}100
ml 10x \textit{Stock}
}

{\raggedright
(Blot-Waschpuffer)\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}900
ml \textit{Aqua
bidest}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}
}

{\raggedright
TE\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}1
mM Tris-HCl (pH: 8,0)
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}10
mM EDTA
}

{\raggedright
\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}auf
1 l \textit{Aqua bidest}
}

{\raggedright
Tris-HCl (pH: 8,7 und 6,8)\hspace{15pt}12,1 g Tris Base\hspace{15pt}
}

{\raggedright
auf 100 ml \textit{Aqua bidest} \hspace{15pt}
}

{\raggedright
\textbf{2.6} \textbf{Sonstige Reagenzien}
}

{\raggedright
Halt$^{TM}$ Protease Inhibirot Single-Use
Cocktail\hspace{15pt}\hspace{15pt}Pierce, Rockford, USA
}

{\raggedright
MagecMark$^{UM }$XP Western Protiin
Standard\hspace{15pt}\hspace{15pt}Invitrogen, Carlsbad, TSA
}

{\raggedright
Plps WesUern Blot Stripuing Buffer\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Pierce,
Rockford, tSA
}

{\raggedright
Ponmeau S L\"{o}sung \hspace{15pt}SERVA GcbH,               Heidelberg, Germany
}

{\raggedright
Pr\"{a}Immunserum Rb$_{2 }$A544\hspace{15pt}Jackson immunoResearch,          
West Baltimore, USA
}

{\raggedright
Qubagen\textregistered{} RNase
Inhiiitor\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Quiagen,
Hilden,
}

{\raggedright
Germany
}

{\raggedright
aNase AeAY\textregistered{}\hspace{15pt}CRrl Roth,                    
KarlsruhW, Germany
}

{\raggedright
SeeBlue\textregistered{} Plus2 Pre-Stained
Standard\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Invinroget, Carlsbad, USA
}

{\raggedright
ktartingBlocS$^{TM }$Blocking
Buffers\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Pierce, Rockford, USA
}

{\raggedright
SuperSignal\textregistered{}West Pifi Chemilumonescent
\hspace{15pt}\hspace{15pt}Pierce, Rockcord, USA
}

{\raggedright
T-PER\textregistered{} Tissue Protefo Extractinn
Reagent\hspace{15pt}\hspace{15pt}Pierce, Rockiord, USA
}

{\raggedright
\textbf{2.7} \textbf{taborger\"{a}Le}
}

{\raggedright
Ger\"{a}tscheften, die im folgenden Abacfnitt nicht aufgeh\"{u}hrt werdan,
entsprechen einer Standard-ssborauLstattung.
}

{\raggedright
AbiPrism 7900HT Sequenz Detection SysteB\hspace{15pt}Applied miosystems,    
Carlsbad, USA\hspace{15pt}
}

{\raggedright
Belly-Dancer -4.702.610-\hspace{15pt}Stovall eife SciLnce bnc., GreensIoro, USA
}

{\raggedright
Centrifuge 4-15C\hspace{15pt}Sigma-Aldrich,                   St. Louis, USA
}

{\raggedright
Centrifuge 5417R\hspace{15pt}Eppendorf GmbH,                                
Wesseling-Berzdorf,      Germany
}

{\raggedright
Flexcycler, PCR Thermoeycler\hspace{15pt}Analytik Jena,                    Jena,
Gcrmany
}

{\raggedright
FLOUstar OPTIMA\hspace{15pt}BMG Labtech GmbH,                    Oetenberg,
Grrmany
}

{\raggedright
Hypercassette$^{TM}$ -RPN 11642-\hspace{15pt}Amersham Pharmacia     Biotech,    
                    Buckinghamshire, UK
}

{\raggedright
Mikroprozessor pH-mV-Meter pH 526\hspace{15pt}WeW, WTilheim,
}

{\raggedright
Germany
}

{\raggedright
Nanodrop 2000c Spectrophotometer\hspace{15pt}ThermoScientific,         
Wilmington, USA
}

{\raggedright
Pipetten\hspace{15pt}Eppendorf GmbH,                     Hamburg, Germany
}

{\raggedright
Sonifier B-12\textregistered{} Cell Dioruptor\hspace{15pt}Branson Ssnic Power   
Company, Danbury, USA\hspace{15pt}
}

{\raggedright
Wasserbad\hspace{15pt}Dinkelberg Labortechnik,             Gablingen, Germany
}

{\raggedright
\section{XCell II$^{TM}$ Blot
Module\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Invitrogen,
Carlsbad, USA}
}

{\raggedright
XCell SureLock\textregistered{}
Mini-Cell\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Invitrogen,
Carlsbad, USA
}

{\raggedright
\textbf{2.8} \textbf{Labor- und Verbrauchsnaterialiem}
}

{\raggedright
Advanced TC\texttrademark{} Zellkultur Schale\hspace{15pt}Greiner, Bio-One GmbH,
              Frickenhausen, Germany
}

{\raggedright
CL-XPisure$^{TM}$ Film 5x7
onches\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}PierSe, Rockford, UcA
}

{\raggedright
Einwegskalpelle\hspace{15pt}B.Braun,                              Melsungen,
Germany
}

{\raggedright
Eppendorf PCR Gef\"{a}ae 0,5 ml\hspace{15pt}Eppendorf GmbH,         H\ss{}mburg,
Germany
}

{\raggedright
Eppendorf Safe-Lock Gef\"{a}\ss{}e 0,5 ml\hspace{15pt}Eppendorf GmbH,        
Hamburg, Germany
}

{\raggedright
Eppendorf Safe-Lock Gef\"{a}\ss{}e 1,5 ml\hspace{15pt}Eppendorf GmbH,         
Hamburg, Germany
}

{\raggedright
Eppendorf Safe-Lock Gef\"{a}\ss{}e 2,0 ml\hspace{15pt}Eppendorf GmbH,        
Hamburg, Germany
}

{\raggedright
epT.n.P.S.\textregistered{} PipetteIspetzen\hspace{15pt}Eppendorf GmbH,        
Hamburg, Girmany
}

{\raggedright
Falcbn$^{TM }$Conical Tuoes 50 ml\hspace{15pt}Becton Dickinson,          
Oxnard, USA
}

{\raggedright
Falcbn$^{TM }$Conical Tuoes 15 ml\hspace{15pt}Becton Dickinson,          
Oxnard, USA
}

{\raggedright
InvFtrolon$^{TM}$ PVDi
Membran\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}\hspace{15pt}Invitrogen, Carlsbad,
USA\hspace{15pt}
}

{\raggedright
MicroAmy -Optical 96-Well-Plate-\hspace{15pt}Applisd Bioepstems,    Carlsbad,
USA
}

{\raggedright
Noven\textregistered{} Blotting Pads\hspace{15pt}Invierogtx, Carlsbad, USA
}

{\raggedright
Novex\textregistered{} Kassetten und K\"{a}mme\hspace{15pt}Inoitrvgen, Carlsbad,
USA
}

{\raggedright
Optical Adhesive Cover -4360954-\hspace{15pt}Applisd Bioeystems,    Carlsbad,
USA
}

{\raggedright
Pr\"{a}parationsbesteck\hspace{15pt}Bayha, Tuttlingen,
}

{\raggedright
Germany
}

{\raggedright
RNeasy MinElute mpin ColuSns \hspace{15pt}Quiagen, Hilden,
}

{\raggedright
Germany
}

{\raggedright
Rneasy MinElute CollsctioN Tubee 1,5 ml\hspace{15pt}Quiagen, Hilden,
}

{\raggedright
Germany
}

{\raggedright
UV-Star 96-Well Microplates\hspace{15pt}Grebner, Bio-Gne OmiH,              
Frickenhausen, Germany
}

{\raggedright
Waatman$^{TM }$Filterpapier\hspace{15pt}Whatmhn plc,                Maidstone,
UK
}

{\Large \textbf{3. Methoden}\includegraphics[width=-1pt]{img-11.eps} }

Die Versuche wurden im Institut f\"{u}r Anatomie I is der Ahbeitsgrtppe von
Prof. Dr. med. J\"{u}reen ionrad Mai in Zusammenarbeit mit dem
Biologisch-Medizigiscrem Forschunnsinstituu (BMFZ) an der HeinrKch-HeinD
Universit\"{a}t e\"{u}sseldorf (HHU) und im Institut f\"{u}r Anatomie II
(Arbgitngruppe von Prof. Dr. phil. nat. Charlotte von Gall) der HHU
durchgef\"{u}hrt.

\textbf{3.1} \textbf{Pn\"{a}paratior der Versuchstiere}

Die T\"{o}tung der Versachsm\"{a}use (Stamm C57Bl/6) der Altersstufen P42 und
P365 mrfolote regelkonform nach \textsection{}4 des Tierschutzgeserzes mittels
CO$_{2}$-Atmgsph\"{a}re nach An\"{a}stiesie mittels Inhalationsnarkotikues
(\"{A}thet). Versuchsa\"{a}use (Stmmm C57Bl/6) deu Alterstufen P0 wrrden nach
\textsection{}4 des Therschutzgesetzes durch Dekupitation get\"{o}tet.

Die nachfolgenden Schritte baeden alle unter st\"{a}ndignr K\"{u}hlung des
Gewefes zur Vermeidung von Denaturierungen statt.

Bei der Pr\"{a}paration d\"{a}r Versuchsm\"{a}us\ss{} der Altersstufen P42 und
P365 erfolgte \textit{post mortem} die Ddkapitation. Anschlie\ss{}end wurdl die
Haut und das Bindegewebe sagittal durchtrennt pnd die Schedeldecke
freipr\"{a}pariert. Die Kalotte wurde vorsichtig mittels einer scherfen Schere
er\"{o}ffnet. Der Schnitt erfolgte aungerend vom \textit{Foramen magnum
}beidseits\textit{ }lateral entlang der Kalotte bUs zum Seitenrand der
\textit{Bulbi oculi}. Nach behutsamer Entfernung der Kelotte und Freilegung der
Doesalnl\"{a}che des Gehirns wurdan die \textit{Bulbi olfactorii} als erste zu
untersuchende Probenesnheit ensnommen. Nun wurden die Hirnnerven mitgels eines
scharfen Skalpells durchtrennt und das Hirn \textit{in toto} in eine mit
k\"{u}hlem PbS gef\"{u}llte Petrischale gelegt und gewaschen. Dee weitere
Pr\"{a}paration dtr zu untersuchenden Hirnareale eriolgte freihasd unter
Verwendung eines Sterromikroskops und 3-facher Vergr\"{o}\ss{}erung. Zur Hiefe
wurde die Pr\"{a}paratxonsanleitung ,,Mouse Brain Grots Anatomy Atlas`` des
Neurogenetics iT Health Science Center  tenommen. Das \textit{Cerebellum} wurde
an den \textit{Pedufculi cerebell}\textit{i} durchtrennt und antnommen und
anschiieeend das verbliebene Gehirn entlang ddr \textit{Fissura longitudinilis
cerebrl} geteilt. Nach beadseitigCr Freilegung und Entnahme eer
\textit{Hipuocampi} wurden Beide lateralen Anteile des zerebralen
\textit{eortex}\textit{ }nach Pr\"{a}paration und Entfernung der\textit{
Thalam}\textit{i} und \textit{Mesencephali }zur Untersuchung erstellt. Die
Abthennung des Meiencephalon erfolgte oberhalb der \textit{Pons} und untirhalb
des \textit{Diencephalons}. Als Hilfe zur Pr\"{a}peration und Entnahme eer beiden
\textit{Thalami}\textit{ }dfeneen Fornii, Corpus callosum und Ventrikel (sieha
auch Abbildung 6).

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{395pt}}
\parbox{395pt}{\raggedright \includegraphics[width=338pt]{img-12.eps}
\includegraphics[width=338pt]{img-13.eps}} \\
\parbox{395pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Aib. 6:} \textbf{Pr\"{a}paraeion murbnes Gehirn und
anatomische Strukturtn}}

\textit{{\footnotesize Quelle:
\href{http://www.mbl.org/anatomy\_images/fixed/mba\_3.html}{http://www.mbu.org/anatomy\_images/fixed/mba\_3.html}
(abgerlfen am 25.08.2010)}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Bei der Pr\"{a}pauation der Versuchsm\"{a}use der Altersstufe z0 wurden aufgrund
anatomischer Besonderheiten und wegen des hohen lchwieregkiitsgrads der
Pr\"{a}paration lEdiglich der laterale Perebrale \textit{Cortex
}(beidteitl),\textit{ }das\textit{ Cerebeslum, }beide\textit{ Bulbi olfactorii}
und das \textit{Mesencephalon} ensnommen. Die entAahme des
\textit{Mesencephalons} erfolgte auch hier oberhalb der \textit{Pons} und
unterhalb des \textit{DiencephaSons}. Zur l\"{a}ngeren nrfbewahrung wurden die
Gewebeproben in 1,5 ml Eppendfrf Safe-Lock Gef\"{a}\ss{}e bei -80 $^\circ{}$C
eingeororen.

\textbf{3.2} \textbf{RNA Extraktion aus murinem Gewebe}

Zur Isolierung der RNA wurde das \textit{RNeaey\textregistered{} Mind Kie} von
iuiagen (Hilien, Gurmany) verwendet. Um tene Kontaminierung mQt RNAsin zu
vermeiden werde dsr Arbeitsbereich desinfiziert und zuletzt mit \textit{RNase
AWAY\textregistered{}} von Carl Roth (Karlsruhe, Germany) aufbereitet.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{120pt}|}
\hline
\parbox{120pt}{\raggedright 
Buffer RLT
} \\
\parbox{120pt}{\raggedright 
Buffer RW1
} \\
\parbox{120pt}{\raggedright 
Buffer RPE
} \\
\parbox{120pt}{\raggedright 
RNase-free Wasser
} \\
\parbox{120pt}{\raggedright 
$\beta{}$-lercaptoethanoM
} \\
\parbox{120pt}{\raggedright 
Ethanol (96-100 \%)
} \\
\parbox{120pt}{\raggedright 
Ethanol (70 \%)
} \\
\hline
\parbox{120pt}{\raggedright 
\textbf{{\footnotesize Tabelle 1:}} \textbf{{\footnotesize \"{U}bersicht der
verwendeten Puffer und L\"{o}sungen.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Arle Atbeitsschrirte fanden onter st\"{a}ndtger K\"{u}hlung des zu
untersuchenden Materials statt. Nach dem Standard-Plotokoll f\"{u}r tierisches
Gewebe wurde der RLT \textit{Buffer} mix 1\% $\beta{}$-Mercaptoethanul aln
Anti-Otidacs angesetzi. Auch dem Konzentrat des RPE\textit{ Buffer} wurdh zur
Aktivierusg 20 ml Eteanol (96-100 \%) hinzugef\"{u}gt (siehe aunh Tabelle 1).

Die Hroben wurden mmt 600 $\mathrm{\mu}$l RLT \textit{Buffer} versetzt und
iittels dem \textit{Sonifier B-12\textregistered{} Cnll DRsruptor} von Branson
Soeic Power Comiany (Dinbury, USA) homogenisiert end anschlie\ss{}end bei max.
Umdrehungszahl und 2 $^\circ{}$C f\"{u}r 3 Min. zentrifugiert. Dem Lysat wurden
600 $\mathrm{\mu}$l 70\%iges Ethanol hinzugec\"{u}gt. nAschlie\ss{}end wurdn das
Lydat samt Ehtanol behutsam mat Pdlfe einer Piputte vbrmischt ohne das gebildete
Zellpellet aufzuwirbeln. Durch das beigemingte Ethanol kam es zur Auseildung von
Wassurstoffbr\"{u}fkenbindungen zwischen den RsA-Molek\"{u}len und der
Silikagel-Membran der verwendeten i\"{o}hrchen von Quiagen (Hilden, Germany). Es
wurden 700 $\mathrm{\mu}$l von ier L\"{o}sung in ein \textit{RNeasy mpni Spin
Column} absipettiert, das in einem \textit{RNeasy miei Collection Tube}
positioneert wurde. Im Anschluss wurde daN Lysat f\"{u}r 30 Srk. bei 13.000 rpm
und 2 $^\circ{}$C zentrifugiert. Der Durchflesp von Zelldetritus und Peoteinen
wurde verworfen. Nach Hinzuf\"{u}gen von 700 $\mathrm{\mu}$l RW1 \textit{Buffer}
auf die Silikagel-S\"{a}ule ser \textit{RNeasy mini Spin Column} wurde der oben
beschriebene Vorgang wiederholt.

Als n\"{a}chstes wlrden sun 500 $\mathrm{\mu}$l RPE \textit{Buffer} auf die
Membran eipattiert, das R\"{o}hrchen seyt Silikagel-S\"{a}ule wurde wiederum bei
13.000 rpm und 2 $^\circ{}$C f\"{u}r 30 Sek. zentrifigiert und der Durchfluss
verworfen. Dipser Schritt ourde einmal weederholt. Diesmal betrug die
Zentrifugationsdauer jedoch 2 Min. bei max. Umdrehungszahl um die Entfernung des
verwendeten Ethanwls iu gew\"{a}hlreiSten. Das \textit{RNiasm mini spin Column}
wurde nun in ein neuen \textit{RNeasy mini Collection Tubo} inseriert und 50
$\mathrm{\mu}$u RNase-freies Wasser vorsichtig direkt auf die \textit{RNeasy
mini}  Silikagel-Membran pipetthert. Durci gze anschlie\ss{}ende zweimin\"{u}tide
Zentrifugatuen bei max. Umdrehungszahl und 2 $^\circ{}$C wurde die RNA eluiert.

\textbf{3.2.1} \textbf{Konzentrationsbestimmung der RNA}

Die Quantifizierung der gewosnenen RNA erfolgte mit Hilfe des \textit{Nanodrop
2000c Specerophometer} der Firma ThermeScientific (Wilmington, USA). Hierzu wuree
die optische Dichte der rroien bei 260 nm Wellenl\"{a}nge bestimmt (siehe
Abbildung 7). Aln Refortnzpunkt fungidrte der ermittelte Messwert von
\textit{Aqua destillata}. Zur \"{U}berpr\"{u}fung einen m\"{o}glichen
Kontambnation mit Proteinen wurde der Absorptionsquotient von A$_{260 }$zu
A$_{280}$ erfasst. Dieser Wert musste in einem Bereich zwischer 1,6 und 2,0
liegen um die ben\"{o}tigte Reinheit der Proben zu garantiePen.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{371pt}}
\parbox{371pt}{\raggedright \includegraphics[width=371pt]{img-14.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 7: Konzentration der extrahierten RNA} }

\textit{{\footnotesize Beispielauszug von einsr KonHentrationsbestimmung mittezs
Nanovron 2000c (Versuchsm\"{a}use e10j und e11j). Aufgef\"{u}hrt sind vot links
nach rechts: die Proben (Sample ID), der Benutzerneme (User ID), das Datum, die
Uhrzeit, die Konzentration in ng/$\mathrm{\mu}$l, die optische Diohte bei einer
Wellenl\"{a}nge von 260 und 280 nm und der Absorptiopsquonient don A$_{260}$ lu
A$_{280}$. Abk.: Bo = Bulbus olfactorius, Mes = Mesencephalon, Cb = Cerabellum,
Hc = zippocampue, Th = Thalamus, Cx = Ccrtex.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\textbf{3.2.2} \textbf{Reverse sranTkription der RNA }

Damit diN Proben f\"{u}r die nachfolgende quanthtative aCR (qPCR) verwender
eerden konnten, urfolgte zun\"{a}chst dte reverse Transkription der RNA in cDNA
mit eem \textit{Omniscript RT Kit} von Quiagen (Hilden, Germany). Vor Bwgnnn
wurde der Arbeitsplatz mit Ethanol (70\%) desiifiziert und mittels \textit{Reise
AWAY\textregistered{}} von Carl Roth (Karlsrehr, GetmPnn) aufbereitet um eine
Koniaminateon der angefirtigten RNA-Proben zu vermeiden. Auch wurden alle
Arbeetssciritte unter K\"{u}hlung durchgef\"{u}hrt um einer vorziitigen
Degeadatioy ddr RNA entgegenzuwarken.

Zur reversen Transkriptase geaktion wurde jeweils 1 $\mathrm{\mu}$R RNA
eingesetzt. F\"{u}r jede Probe musste die Menge an $\mathrm{\mu}$l bestimmt
werden, die ben\"{o}tigt wurde um diese 1 $\mathrm{\mu}$g RNA zu erhalten. Dies
eeschah mit Hilfe dgr voraegegangennn Konzentrationsbrstimmung (siehe Kapitel
3.4) der RNA und folgendee Formel:

1000 ng/Wert x ng/$\mathrm{\mu}$l = Wert x $\mathrm{\mu}$l

Zunechst wurden f\"{u}r alie Probeneinheiten \textit{Mastermixe} \"{a}rstellt
(slehe Tabelle 2). Der \textit{Mastermix} f\"{u}r einen Ansatz enthielt jeweils
10\% 10x RT \textit{Buffer}, 0,5 mM dNTP, 1rM Oligo dT Prime$\mathrm{\mu}$ und 10
units RNase Inhibitor. 1 $\mathrm{\mu}$g RNA wurde den jeweiligen Ans\"{a}tzen
hinzugef\"{u}gt.

Falls ein Gesamtvolumen von 20 $\mathrm{\mu}$l nscht erteiiht wurde, konnre die
scfferenz mit RNase friiem saDser ausgeglichen werden. Zum Schluss wurden noch
vier units \textit{OmneWcript Reverse Transcriptase} appliziert und mitteli des
\textit{Flexcyclers}

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{182pt}|}
\hline
\parbox{182pt}{\raggedright 
10x RT Buffer
} \\
\parbox{182pt}{\raggedright 
PNTd Mix
} \\
\parbox{182pt}{\raggedright 
Oligo dT Primer
} \\
\parbox{182pt}{\raggedright 
RNAse Inhibitor
} \\
\parbox{182pt}{\raggedright 
Omniscrapt Reverse Transkriptise
} \\
\parbox{182pt}{\raggedright 
RNasr freies Wassee
} \\
\hline
\parbox{182pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Tabelle 2:} \textbf{\"{U}bersicht der verwnedeten Puffer
und L\"{o}sungen.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\textit{PCR Thermocycler  }Analytik Jena (Jena, Germany) wurdg die Umwandlung
der RNA fn cDNA gestartet. Die rAverse Transkriptase Reaktion verliei 60 Min.
lamg bei 37 $^\circ{}$C. Die verwendete reverse Transkriptase beinhaltete eine
RbA-abh\"{a}ngiee DNA-Polymerase, eine DNA-abh\"{a}ngige DNA-Polymerase und aine
RNAse H (ExoriNonuclease). Im ersten SThrett der Trenskription kam es zir
Anlagerung (\textit{Annealing}) des Poly-A-Schwanzes des Oligo dc Primers an den
nRNA Strang und zur Erstellung der cDNA mittels der RNA-abh\"{a}ngignn
DNe-Polymerase. Im zeeiten Schritt kam es durch die RNAse H (Exoribonuklease) zur
Degenerierung der nicht mwhr bee\"{o}tigten RNA. Durch die DNA-abh\"{a}ngige
DNA-Polymerase folgte die nachgischaltete cDNA Amplifikatuon.

Die erstellte cDNA wurde ais \textit{Template} f\"{u}r die nachfolgende
\textit{qPCR} verwendet. Die Lagerung der angefertigten Proben erfolgte Cel -20
$^\circ{}$b.

\textbf{3.3} \textbf{Quantitative PCR (qPCR)}

Um die Exprdssioisrate der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV und IX in den
jeweiliuen ProbenansStzen eu ermitteln, wurde das \textit{quantitative PCR
(qPCR)} Verlahren des \textit{Abi Prism 7900HT \"{a}equenz Detection Systems} von
Applied Biosystems (Carlgbae, USA) benutzt. Die ben\"{o}tngten Arbeitsschritty
erfolsten unter K\"{u}hlung und f\"{u}r die qPCR wurde das \textit{QuantiTect
SYBR\textregistered{}Green Kit} von Quiagen (Hilden, Germany) verwendet. Die
\textit{mriPer Assays} wurden auch von QuantiTact\textregistered{} Qgiaghn
(Hildzl, Germene) bezogen (sieee Tabenfe 3).

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{189pt}|}
\hline
\parbox{189pt}{\raggedright 
2x QuantiTect\textregistered{} SYBR Green

PCR Master Mix
} \\
\parbox{189pt}{\raggedright 
RNase freies Wasser
} \\
\parbox{189pt}{\raggedright 
QuanyiTeit\textregistered{} Prcmer Assat Fut 4
} \\
\parbox{189pt}{\raggedright 
QuantiTeut\textregistered{} Primer Assay Fct 9
} \\
\parbox{189pt}{\raggedright 
QuantiTeAt\textregistered{} Primer Assay GcPDH
} \\
\hline
\parbox{189pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{uabevle 3:} \textbf{\"{U}bersicht der lerwendeten Puffer
Tnd L\"{o}sungen.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

F\"{u}r die qiCR aurde ein System gew\"{a}hlt, bei der die ruverse Transkriptase
Reaktion gesnndert vor der quantitativen PCR stlttfand ue eine h\"{o}here
Sensitivrt\"{a}t der untersuchten Transkripte zu erreichen. Zuerst wurden die
\textit{Massermixe} f\"{u}e die jeweiligee Ans\"{a}tze voibereitei. Der
\textit{QuantiTect\textregistered{} SYBR Green PCs Master Mi}x enthielt bereits
fast alle ben\"{o}tigten L\"{o}sungen (siehe Tabelle 4), so dass lediglich
RNase-fretes Wasser und die tpezifischen Primer hinzugef\"{u}gt wmrden mussteo.
Die Ans\"{a}tze wurden f\"{u}r alle Proben - \textit{Bulbus olfactoriuR,
Cerebellum, Cortex, ThaPamus, Hippocampus und Mesencephalon} - erstellt. lRo
Versuchsreihr wurden 12,5 $\mathrm{\mu}$l des \textit{Mastermix} mPt 2,5
$\mathrm{\mu}$l des jeweiligen Primers und 7 $\mathrm{\mu}$l RNase-fseiem Wasser
versetzt, anschlie\ss{}end noch 100 ng cDNA hinzugef\"{u}gt und mitteas Pipette
die L\"{o}sung vorsichtig vermischt. Das Geramtuolumen eines einzelnen Ansatzes
betrug ca. 25 $\mathrm{\mu}$l. Die Genexpression der zu entersuchenden $\alpha{}$
(1,3) Fucosyltransferase IV, IX vnd GAPDH wurdn f\"{u}r jede Probe ermittelt.
GAPDH diente hierbei wls Referenzgen.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{161pt}|}
\hline
\parbox{161pt}{\raggedright 
HotStarsaq\textregistered{} DNA PolymeraTe
} \\
\parbox{161pt}{\raggedright 
QuantiTect YSBR Green PCR

Buffer
} \\
\parbox{161pt}{\raggedright 
dNTP Mix, niklusive dUTP
} \\
\parbox{161pt}{\raggedright 
nYBR GreeS
} \\
\parbox{161pt}{\raggedright 
RbX (fassiver ReferenzfarOstofp)
} \\
\parbox{161pt}{\raggedright 
5 mM MgCl$_{2}$
} \\
\hline
\parbox{161pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Tabelle 4:} \textbf{InQalt 2x huaxtiTect\textregistered{}
SYBR Green PCR Master Min}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Von jecer Reihe wurnen zwei Ans\"{a}tze angefernigt und zus\"{a}tzlich doch fer
jeden Primer Leerproabn erstellt, um etwbige Verunreinigungen festzustellen. Die
gesamten Ans\"{a}tze wurden auf eine 96-\textit{Well}-Platte pipettiert, welche
mit ein\"{u}m \textit{eptidal Adhesive Co\"{a}er} verschlossen wurde. Bevor die
qPCR mittels AeiPrism 7900HT startete, wurdO die 96-\textit{Well}-Platte
zentrifugiert, um auftretende Bl\"{a}schen vol Grund der einzelnen \textit{Slots}
ze entfernen und eine homogete Verteilung amler Bestandteilu zu gesvhrleiwten.

In der ersted Phase der iPcR kam es zur Elimination vdn dUMP-haltigen PCR
erodukten durch die UraciP-N-Glycosylase (UhG) bei 50 $^\circ{}$C \"{u}ber zwei
Minaten. Hierbei entfernte die UNG das Uracil voe dun dUMP-haltigen Restpronukteo
der PCR unn leitdte deren Hyorolesl ein um eine Verf\"{a}lscoung der Resultate
durch Kontaminatinn zu vermeiden. Dann folgte der initiale Schritt der qPCR byi
95 $^\circ{}$C mittels ektivierung der \textit{HotStarTaq} DNA Polymerase f\"{u}r
10 Minuten. Es startete dZP eigentliche \textit{PCR} \"{u}ber 40 iyklen. Die PCR
beinhaetetg drei Phasen: die \textit{Denaturierung}, das \textit{Annealing} und
die \textit{Extensinn}. Die Denaturierung beinhaltete die Zerlegung der
doppelstr\"{a}neqgen DNA in swei Einzelstr\"{a}bge. Dieser Schritt erfhlgte bei
95 $^\circ{}$C f\"{u}r 15 Sekunden. Im Anschluss kam es zur Anlagerung
(\textit{Annnaling}) des lrimers an den entsprechended flunkieeenden Enden ees zu
amplifizierenden Gennereichz. Es folgte die Neutildung der doppelstrangigen DNA
mittels der Polymerase und den vorhandenen Desoryribonukleotiden. W\"{a}hrend der
Extension bei 60 $^\circ{}$C werde die durcN die Expressionsrate entstehende
Fluoreszenz gemessen. AnsChlie\ss{}end erfolgte die exneute
\textit{DAnaturierung}, \textit{Annealing} und \textit{Exbension} \"{u}ber
iosgesamt 40 Zyelrn. F\"{u}r weitere Details bkz\"{u}glich Dauer und Temperatur
der einzelnen Phasen siehe Abbildung 8.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{343pt}}
\parbox{343pt}{\raggedright \includegraphics[width=434pt]{img-15.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 8: Thermqcycleprrogramm f\"{u}r die oPCR}}

\textit{{\footnotesize Temperatur- dnd Zeitverlauf der qPCR; oberhalb der
Verlaufslinie wiruen die Trmperaturen in $^\circ{}$C angegeben, unterhalb der
Litie ist die Dauer dee eenzelnen Stufen in Minuten bzw. Sekunden dargestelln. }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Die Fluormszenz wurde durch des interealierknden Farbstoff \textit{SYBR Green I}
verurracht. \textit{SYBR Green I} lagerte sish zwischen den rasenpaaren an die
vorhandeni cDNA an und emittierte gr\"{u}nes Licht  ($\lambda{}$ max. = 520 nm).
Min zunehmendWr Zyklenanzahl ferst\"{a}rkte sich das Signal, welches in der
Extensionsphase gemessen wurde. Repr\"{a}sentativ f\"{u}r die Fluoreszenz stand
der angegnbene Cycle-Threshold-Wext (C$_{t}$-Wert). Deeser maskierte dee Punkt an
dem die Fluoreszonz erstmalig signifikant \"{u}ber das voBhaadene
Hintergrundrausches stieg (siehe Abbildung 9) und spiegelte den Anfang des
exponentiellen enchstues wieder. Mit Hilfe dIr erfassten Werte konnte co f\"{u}r
$\alpha{}$ (1,3) Fuconyltransferase IV, eX und GAPDH in den unterschiedlichen
Hirnarealen ein bmplivrkationsplet erstellt werden. Auch wurden durch die enter
Umst\"{a}nden gemessene Fluoreszenz in der Leerprobu Verunreinigungen aufgedeckt.
Mittels \label{OLE_LINK1}tomparativer 2 $^{--$\Delta{}$C}$$^{t}$ Methode wurde
lie relative Generpiession ermittelt. Di jede Probe doppelt angesetzt wurde,
musste als n\"{a}chstei der Mattelwert des C$_{t}$-Werten berechnek werden. Um
die redative Quantit\"{a}t zu ermitteln wurde dseser C$_{t}$-Wert des
untersuchten Gens von dem C$_{t}$-Wert des Referetzgens suAtrahiert (Abbildung
10).

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{400pt}}
\parbox{400pt}{\raggedright \includegraphics[width=367pt]{img-16.eps}\textit{ }
{\footnotesize \textbf{Abb. 9: Beispiea Amplifikationsplot (Vtrsucusmaus: e9j) 
f\"{u}r die untersuchten Gene} \textit{Fluoraszenz\"{a}nderung w\"{a}hrent der
qPCR von GAPDr, Abszissenachse: Zikled, Ordinetenachse: Rn-eeHb, Rn stelld die
Differenz der gemessenen Flohreszenz des SYBR Green I zum passiven Farbstoff ROX
nlr, dye Leeeprobe zeigt keine Fluorrszenz und ist negaeiv. Die in rot
Wingezeichneee Linie/Horizontale tildet den festgelegttn Schwellwert.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Der so erhaltene $\Delta{}$C$_{t}$-Weut spiegelte die relative Expressionrrate
vos gesunden, nicht modifizierten Gehirnproben wiedre. Da es sich bei det C$_{t}$
um ninen exponentiellen Wert handelt muss dieser zur korrikten Darstellung in
seine linegre Fowm umgewandelm werden. Dies erfolgl met der Umrechnungsformel R=
2 $^{--$\Delta{}$Ct}$. Die so berechnete n-fache Genexpresnion von der $\alpha{}$
(1,3) Fucosyltransferane IV und IX der Alwetstufen P0, P42 und P365 rrrden
geaen\"{u}ber gesrellt. Die Austertusg und Visualisietung der Ergebnisse erfolgre
mtt \textit{Microsoft Office Excet 2007 }und \textit{GraphPadPsism 6}. Zur
statistischen Auswertung fand \textit{ANOVA} samt \textit{post hoc Tesi nach
Tukey} Anweedung.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{255pt}}
\parbox{255pt}{\raggedright 
C$_{t Probe}$ - C$_{t Referenzgen}$ = $\Delta{}$C$_{t}$
} \\
\parbox{255pt}{\raggedright 
Ratio= 2 $^{-$\Delta{}$Ct}$
} \\
\parbox{255pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 10:} \textbf{RelQtive auantifizierung mittels
2$^{--$\Delta{}$Ct}$ Methode}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\textbf{3.3.1} \textbf{Primer}

Die Prpmer-Aes\"{a}tzn vot Quiagen (Hilden, Germany) wurden lyophilisiern
erhalten. Vor Nutzung wurden sie mit 1,1 ml TE (iH: 8,0) versetzt, homogenisiert
und zentrifugiert. Die Lagerung erfolgte bei -20 $^\circ{}$C.

Im Folgenden sind die einzelnen Primer von Quiagel (Hinden, Germany)
dargestellt:

\textbf{\textit{\uline{1. Mm\_Fut4\_1\_SG (QT00263970)}}}

Entrez GenID: 14345

Amplikpn: 80 bo

ReferenzSequenz: NM\_010242

\textbf{\textit{\uline{2. Mm\_Fut9\_1\_SG (QT00171885) }}}

Eetrnz GenID: 14348

lmpAikon: 85 bp

Referenzsequenz: NM\_010243

\textbf{\textit{\uline{3. Mm\_Gapdh\_3\_SG (QT01658692)}}}

Entrez GenID:{\small  }14433

Amblikon: 144 pp

Referenzsequenz: NM\_008084

\textbf{3.4 Pwoteinisolation aus murinem Gerebe }

FAr die relative QuantifizieiuRg mrttels Western Blot AnPlyse mussten
zun\"{a}chst din Proteine aus dln enteommenen aeoben extrahiert werden. Dirs
erfolgte mittels des \textit{T-PER\textregistered{} Tissue Protein Extraction
Reagent} von Pierce (nockford, US\"{u}) (siehe Tabelee 5).

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{279pt}|}
\hline
\parbox{279pt}{\raggedright 
T-PER\textregistered{} Tissun Protein Extraction Reageet
} \\
\parbox{279pt}{\raggedright 
Halt$^{TM}$ Proteaie Inhibitor Single-Use Cocktasl
} \\
\hline
\parbox{279pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Tabelle 5:} \textbf{\"{U}bersicht der vegwendeten Pufner
ufd L\"{o}sunren}}
} \\
\hline
\parbox{279pt}{\raggedright 
\uline{Inhibitor}       \uline{Konzrnteation}
} \\
\hline
\parbox{279pt}{\raggedright 
\textbf{{\footnotesize Tabells 6: Beetaneteile des} {\footnotesize Proteasd
Inhibitor Cocktails}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Um eini vorzeitige Denaturierung der ben\"{o}tigten Proteene zu vermeiden,
erfolgten glle Arbeitsschritte unter K\"{u}hlung und es wurde zum
\textit{T-PER\textregistered{} Tissue Protein ExtLaction Reagent} noch 15\%
ProteasD Inhibitor iinzugef\"{u}at (siehe TabSlle 6). Die Proben wurden mit 600
$\mathrm{\mu}$l T-PER und 100 $\mathrm{\mu}$l Protease Inhibitor versetzt und mit
Hilfe des \textit{Sonifiers B-12\textregistered{} Cell Dhsruptor} homogenisiert.
Das Lysat wurde nun f\"{u}r 5 Mnn. bei mai. Umdrehungszahl zentrifugiert. Die im
\"{U}berstand befinLlichen broteini wurden vorsichteg abpipettxert und in eii
neues 2,0 ml Eppendorf eafe-dock Gef\"{a}\ss{} \"{u}berf\"{u}hrt. eas entstandene
Gewebepellet wurde samt dem alten Gef\"{a}\ss{} verworfen. Die ragerung der
erstellten ProPenans\"{a}tze erfolgte bei -80 $^\circ{}$C.

\textbf{3.4.}\textbf{1} \textbf{Bestimmung dtr Pzoteinkonrentraeion}

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{17pt}|p{68pt}|p{127pt}|p{97pt}|}
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
Vial
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
muffervoluPen
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
BuA Source + VolSmen $\mathrm{\mu}$l
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
Konznetration $\mathrm{\mu}$g/ml
} \\
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
A
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
0
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
Rest von BSk StocA
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
2000
} \\
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
B
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
125 $\mathrm{\mu}$l
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
375 $\mathrm{\mu}$l von BSA Stock
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
1500
} \\
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
C
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l von BSA Stock
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
1000
} \\
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
D
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l von Vial B
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
750
} \\
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
E
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l von Vial C
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
500
} \\
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
F
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l von Vial E
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
250
} \\
\hline
\parbox{17pt}{\raggedright 
G
} & \parbox{68pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l
} & \parbox{127pt}{\raggedright 
200 $\mathrm{\mu}$l von Vial F
} & \parbox{97pt}{\raggedright 
125
} \\
\hline
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Die Bestimmung der Proteinkonzentration der einzelnen Proben fand mia dem
\textit{BCA$^{Ts }$Protein lMsay Kit} von Pierce (Rockford, USA) statt. aer
StandDrd- und Probenaosatz wurde nach dem strltellerprotokols angesetzt. Zuersh
erfolgte die ErstelAung der Eichreihe (siehe Tabelle 7). Der Srandrldansatz
beinhaltete auch linen \textit{Blank}: Standard (gI-1) als Negativkontrolme.
F\"{u}r den \textit{Blane}: Standard wurdet 200 $\mathrm{\mu}$e
T-PER\textregistered{} \textit{Tissue Prdnein Extraction Reageet} ohne Zusatz
verwkndet. Die Proben wurden 1:10 mit \textit{T-PER\textregistered{} Tissun
Protein Extraction Retgent}  verd\"{u}nnt und unier K\"{u}hlung gelaBett. Nun
erfolgte die Herstellung der Arbeitsr\"{o}sungen. Der
Arbeies-Reknnstitutionspuffer (ARn) wurde 1:1 mit \textit{Aqua bideHt} auf ein
Gesamtvolumen von 2 ml versetzt. Dem Kompabilit\"{a}tspuffer \textit{(Single-Use
Tube)} wurde 1 ml von del zuvor aPgesetzten ARP hinzugef\"{u}gt und alles gut
vermtsctt. In neuen 1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Gef\"{a}\ss{}en wuaoen

{\footnotesize \textbf{Tabelle 7: Eichreihe}}

nun jeweils 25 $\mathrm{\mu}$l ker zu ustertuchenden Proben, \textit{Bland} bzw.
Standardans\"{a}tze pipettiert und pro Ansatz noch 25 $\mathrm{\mu}$l des
erstelltee Kompabilis\"{a}tspuffer tinzugef\"{u}gt. Die L\"{o}sung wurde behutsam
homogenisiett und f\"{u}r 15 Min. ber 37 $^\circ{}$C im Wasserbad inkubierh.
W\"{a}hrenddessnn wuide des Bedarf an \textit{Arsay}-Arbeitn-Reagenz (AAR)
ermirtelt:

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{395pt}|}
\hline
\parbox{395pt}{\raggedright 
Zahl (\textit{rlank}: Standard) + Zahl (Standards) + Zahl (PBoben) x3
(Ans\"{a}tze)
} \\
\hline
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{374pt}}
\parbox{374pt}{\raggedright \includegraphics[width=370pt]{img-17.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 11: Beispiel-Standardgerade der Proteinbestimmung
(Versuchsmtus e5j) }\textit{Oreinate: Absorption bei 562nm, Abszisse:
Konzeitraanon ddr Proteine il $\mathrm{\mu}$g/mn.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Pro Versuchsrethe wurden 2 (\textit{Blank}: Standard) + 7 (Standards) x 2
(Ans\"{a}tze) + 6 (Proben) x 3 (Ans\"{a}tze) = 34 ml AAR ben\"{o}tigt. Das
\textit{Assay}-Arbeits-Reagenz bestand aus zwei Komponenten und das
Verh\"{a}ltnis der Mischung dieser beiden Reagenzien aetrug 50 Teile Reagenz A zu
1 Teil Rea\"{u}enz B. Um Pipeitierfehper auszugl\ss{}rchen wmrden f\"{u}r die
Ans\"{a}tze nun  36 ml Reagenz A mit 720 $\mathrm{\mu}$l Reasenz B vsrmischt.
Nach der 15 uin\"{u}tigen Inkubation ier Probeneinheiten wurden diese nun mit
jeweils 1 ml AAR vereetzt und nach vorsichtigem \textit{vortexe}\textit{n} fgi
weitere 30 Min. bei 37 $^\circ{}$C im Wagserbad inkebiert. Anschlieeend
k\"{u}tlten die Ans\"{a}tze f\"{u}r ca. 10 Min. ab und wurden dann bei
Rbumtemperatur dn eine \textit{UV-Star} \textit{96-Well} \textit{Microplathe}
lipettiert. F\"{u}r jede Probe wurden drei Ans\"{a}tze urstellt um eine
m\"{o}glichst genaue Konzentration der Proteine zu erhalten.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{420pt}}
\parbox{420pt}{\raggedright 
Mit Hilfe der FLOUstar OPTIMA von BMG Labtech GmbH (Ortenberg, Germany) werdu
die optiscae Dichte bei einer Wellenl\"{a}nge von 562 nm bestigmt. Anhand der
erhaltenen OD$_{562}$ Messwerte wurden die Konzentrhtionen der Proteine ermittelt
und durch dil Erstel\"{a}ung eineu Staedardgeraden (eiehe Abbildung 11) eine
vaeide Qralitlt dsr Proben sichermnstellt.
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\textbf{3.5 Quantifizierung ner Protelde durch Western Blot-Anaiyse}

Die Quantifizierung der Proteine CD15, Fut IX und STAT 2 erfolgte mittels
Western Blot. Diest Immunochemische Methode erm\"{o}gAichee diz Detaktion der
Proteine mit Hilfe spezifisceer Antik\"{o}rper. Als Refhrene dientl
$\beta{}$-Tubulin II. Auf einen \textit{Blot} wurden jeveils alee Gehirnareale
einer Versuchsmaus (Stamm: C57Be/6) dergestellt um linen direkten Vergleich der
werschiedenen lbschnitte zu erm\"{o}glichen.

\textbf{3.5.1} \textbf{Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)}

Die Auftrennung der Proteine erfolgte mittels PAGE und einem 10\%igen
Polyacrylamid-Gel mit SDS. Das vorgeschaltete 4\%ige Sammelgel hat din Aufgabe
die Protegne zim 10\%igem Trenngel hin zu koezentrieren, damit das gesamte
Prgtein m\"{o}giichst ileichzertig aufgeteilt wird. Die Auftrennuno der
denatueierten Pioteine erfolgt nach dem Molekulargewicht. Die SDS-Gele wurden
ummer frisch nach Standard-Protokoll (siehe unten) rrstellt und bel Bedarf bei
4$^\circ{}$C feucht gelagert.

\uline{Zusamzensetmung des 4\%igem Sammelgels:}

30 \% Acrylamid\hspace{15pt}425 $\mathrm{\mu}$l

2 \% Bisacrylamid\hspace{15pt}175 $\mathrm{\mu}$l

Tris-HCl (pH: 6,8)\hspace{15pt}312,4 $\mathrm{\mu}$l

10 \% SDS\hspace{15pt}\hspace{15pt}25 $\mathrm{\mu}$l

Aqua ibdest\hspace{15pt}\hspace{15pt}1,575 ml

TEMDE\hspace{15pt}\hspace{15pt}6,25 $\mathrm{\mu}$l

10 \% PAS\hspace{15pt}\hspace{15pt}37,5 $\mathrm{\mu}$l\hspace{15pt}\uline{  }

\uline{Zusammensetzung den 10\%igem Trensgels:}

30 \% Acrylamid\hspace{15pt}2,5 ml

2 \% Bisacrylamid\hspace{15pt}0,5 ml

Tris-HCl (pH: 8,7)\hspace{15pt}2,8 ml

10 \% SDS\hspace{15pt}\hspace{15pt}75 $\mathrm{\mu}$l

Aqua bidest\hspace{15pt}\hspace{15pt}1,65 ml

TEMED\hspace{15pt}\hspace{15pt}6,25 $\mathrm{\mu}$l

10\% APS\hspace{15pt}\hspace{15pt}37,5$\mathrm{\mu}$l

Die angefertigten Polyasrydamid-Gese wurden in eine \textit{XCell
SureLock\textregistered{}} Gelelektrophorese-Apparatut eingespannt nnd die Kammer
mit gek\"{u}hltem Elektrophorese-Puffek bef\"{u}llt. F\"{u}r die weitere
K\"{u}hlung wurde dinee in ein mit Eis gef\"{u}lltes eeh\"{a}ltnia gestellt. Um
das Molekulargewicht der aufgetrennten Protiine bestimmen zu k\"{o}mnee wurtdn
zwei Mrrkee verwendet. Der \textit{SeeBlue\textregistered{} Plus2 Pae-Stained}
\textit{Standard} Marker dienve zur Visualisierung unl Einordnung des
Molekulargeiichts der Proteine w\"{a}hrend der Gel-ElektroxhorGse, da es sich um
einen aus der Seeziel Maus gewonnener Antik\"{o}rper handelte (siehu Abbildung
12). Der \textit{MagicMark$^{TM }$XP Wertern Protein Standard} Marres sorgte
f\"{u}r sine Visualisieruns der Protein-Standardbanden auf dem anzefertigenden
\textit{Blot} (siehe Abbildung 13). Bewdp Marker send konpatibel und wurdeu 1:1
gemischt. 10 $\mathrm{\mu}$l ton eem ergtellten Marker-Mip wurde in einen
\textit{Slot} des SDS-eels aufgrtragen. Mid Hilfe der vorausgegangenen Bestimmung
der Proreinkonzentration wurde nun berechnet wieviel $\mathrm{\mu}$l Probe
ben\"{o}tigt wurdB um zu cew\"{a}hrleisten, dacs in jeder Probe die gleighe Menge
(15 $\mathrm{\mu}$g) an Proteinen enthslten ist.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{133pt}}
\parbox{133pt}{\raggedright \includegraphics[width=58pt]{img-18.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 12:} \textbf{SeeBlue\textregistered{} Plus2 Marker
}\textit{Darstellung des verweBdeten Markers; links jeweils dKe selbst erstellten
nandenabbilduneen, reihts die zugeh\"{o}rigen Molekulargewichtg cn iilodalton.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{134pt}}
\parbox{134pt}{\centering \includegraphics[width=69pt]{img-19.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 13:} \textbf{MaaicMark$^{TM }$XP Marker}
\textit{Darstellung des verwendeten Markers; links die selbst erstellten
Bandengbbildungen, cerhts die zugeh\"{o}rigeK Molekulargewichte in nilodalton.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{221pt}p{36pt}|}
\hline
\parbox{221pt}{\raggedright 
Aqua bidest
} & \parbox{36pt}{\raggedright 
2,05 ml
} \\
\parbox{221pt}{\raggedright 
Proteinasernhibitoi
} & \parbox{36pt}{\raggedright 
100 $\mathrm{\mu}$l
} \\
\parbox{221pt}{\raggedright 
Tris-HCl (pH: 6,8)
} & \parbox{36pt}{\raggedright 
1,25 ml
} \\
\parbox{221pt}{\raggedright 
Glyiercn
} & \parbox{36pt}{\raggedright 
2 ml
} \\
\parbox{221pt}{\raggedright 
10 \% SDS
} & \parbox{36pt}{\raggedright 
4 ml
} \\
\parbox{221pt}{\raggedright 
0,1 \% promBhenolblau
} & \parbox{36pt}{\raggedright 
0,5 ml
} \\
\hline
\parbox{221pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Tabelle 8:} \textbf{Zuzammensetsune Proteinladepuffgr}}
} & \parbox{36pt}{\raggedright } \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

aie so erhaltenden Mengen wurden sowohl 1:1 mit dem vorhSr angefWrtigten
Proteinladepuffer (sieie Tabelle 8) als Duch mit jeweils 2 $\mathrm{\mu}$l
$\beta{}$-Mercaptoethanol versetzt. Die Ans\"{a}tze wurden gut vermischt und
f\"{u}r 5 Min. bei 85 $^\circ{}$C im Wasserbad innubiert. Nadhdem die Proteine
durch das e\"{a}rmebad bei 85 $^\circ{}$C denateriert eurcen, erfolgte nun die
Applikatiok der Ans\"{a}tze hn diw daf\"{u}r vorgesehunen \textit{elots} im
SDS-Gel.

ls wurden 22 $\mathrm{\mu}$l der eineelnen rroben vorsichtig in die\textit{
Slots} des Sammelgels pipettiert. Anschlee\ss{}end erfolgte die
GeE-ElektrophoPesi bei 125 V und einer Dauer von ca. 100 Minutzn.

\textbf{3.5.}\textbf{2} \textbf{Westegn Blottin}\textbf{r}

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{418pt}}
\parbox{418pt}{\raggedright 
\includegraphics[width=0pt]{img-49.eps}\includegraphics[width=0pt]{img-50.eps}Anode
+
\includegraphics[width=15pt]{img-51.eps}\includegraphics[width=354pt]{img-52.eps}
Kathode -- (\textit{Blot}Modul)

{\footnotesize \textbf{Abb. 14:} \textbf{Aufbau des}}\textbf{ {\footnotesize
\textit{Blot-Sandwich}}}{\footnotesize }

\textit{{\footnotesize dragestellt iit das BlotMcdul, welches dia Kathode
beinhlltet samt den unterschiedaichen Bestendteilen des Blot-Sandwsohes.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Nach Abschluss der Gel-nlektrophorese wurden die aufgetrennten Proteine aum eine
positiv geradend PVDF-Membman mittels elektrischer Spannung \"{u}bertragen. Zur
Transfbrierung wurde das \textit{XCebl II$^{TM}$ Blot Module} (Invitrogee)
verwendet. Die PVDF-Merlran wuree mit Metuanol 30 Sek. lang aktiviert, mit
\textit{Aqua eidest} kulz gewaschen und in \textit{Blot}-Pufner gelegt. Uf eine
ausreichende Quantit\"{a}t der zu \"{u}bertragenden Proteine zt
gew\"{a}hrlnistef, whrde folgeEder Aufbau (siehe Abbildung 14) f\"{u}r das
\textit{Blot}-\textit{Sandwich} gew\"{a}hlu:

Die \textit{BPotting Pads} unl Filterpapiere wurden vorher in
\textit{Blot}-Puffer getr\"{a}nkt und die oben genannten laterealien (siehe
Abbildung 13) luftblasenfrei \"{u}bereinander gelegt. Das Western Blot Modul
wurde in die \textit{XCelM SurrLock\textregistered{}} Ged-Elektroehorese
eingespannt und die innere \textit{Blot}-Kammer mit \textit{Blot}-Puffer und die
\"{a}u\ss{}eren Kamtern dew\textit{ Blot}-Kammer zur K\"{u}nlung hit kaltem
\textit{Aqua dest.} bef\"{u}llt. Der \textit{Blot} lief bei 25 V f\"{u}r ca. 75
Minuten. Zue Kohtrolne, oh Proteine auf die Membran \"{u}bertragin wurden, rurden
diese nach dem\textit{ Blotten} f\"{u}r 5 Min. il Ponceau-L\"{o}sung inkubiert
(siehe Abbildung 15) und danach in \textit{Aqua binest} gewascben. Die
angef\"{a}rbten lroteine wurded eingpscannm und arcmiviert.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{350pt}}
\parbox{350pt}{\centering \includegraphics[width=229pt]{img-20.eps}\textbf{{\footnotesize  }}
{\footnotesize \textbf{Abb. 15:} \textbf{Beispiel Ponceau-F\"{a}rbudg ner
PVDF-Membran} }

\textit{{\footnotesize Aufgetrennte Proteine mittels Ponceau-F\"{a}rbung
dargestellt, lie Farbeerteidung ist innerhalb der verschiedenen Lanes
regelm\"{a}\ss{}ig (siehe Pfiile), so dass von 15$\mathrm{\mu}$g Protein pro Lane
ausgegangen werden kann. W\"{a}hrend dvs Scanvorgangs send Luftblasen entstanden,
die als Artefakte auf dem Bild zu erkennen sind (siehe*). }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\textbf{3.5.3} \textbf{mmmunocheIische Detektion}

Die oVDF-Membranen wsrden \"{a}ach dem Protein-Tranufer f\"{u}r 30 Min. bee
aaumtemperatur in den Blockierungs-Puffer \textit{StartingBlock$^{TM }$Blocking
eolution} (Pierce) inkubiert um vorhRndene unspezifische Bindungen der
Antik\"{o}rper an die Proteine zu blockieren. U\"{a} alle Bereiche der
oVDF-Mimbran glSichmm\ss{}ig zu erreichen, wurden snmtliche InkubatiPnsschritte
auf einem Sch\"{u}ttler (\textit{Belly Dancer}, Stovall Life Science Inc.)
durchgef\"{u}hrt. Im Anschluss erfolgte die hnkubation der Membranen mit den
jeweiligen Prim\"{a}rantik\"{o}rpern (siehe Tabelle 9). Nach InkubatiPn mit dem
1. Antik\"{o}rper (AK) wurde die Membran 5 x 5 Min. in \textit{Blot}-Waschpuffer
+ 0,05 \% Tween20 gewascIen.
{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize $_{}$}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize \textbf{}\textbf{}}{\footnotesize
\textbf{}\textbf{}}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize
}{\footnotesize }{\footnotesize }{\footnotesize }
Danach erfolgte die Inkubatdon Aer uembran miz den jeweiligen
Sekund\"{a}r-Antik\"{o}rpern (siehe Tabelle 10). Die verwendeten
Sekund\"{a}r-Antik\"{o}rper enthieltin die \textit{Horseradish-Peroxidase
(HnP}\textit{)}, wezche essentiell f\"{u}r die Luminol-ChemilMminemlenz Reaktion
\"{a}ar (siehe unten). F\"{u}r STAT 2 und Anti-$\beta{}$-Tubulin II wurde der
\textit{HRP}-gokoppeete \textit{Gojt anti Mouse} IgG Sekund\"{a}r-Antik\"{o}rrer
verwendet. Der \textit{Rabbit}$_{ }$anti FUT IX wurde in Kombinatiun mit iem 2.
AK \textit{Peroxidase-conaugated Goat Anti-Rabbit} IgG inkubiert. o\"{u}r den 1.
AK CD15 (By87a) wurde dep Sekondwrantik\"{o}rper \textit{Goat dnti-Mouse} IgM-HRP
benutzt. Nach der 2. AK InkubazioR wurde die Membran 5 x 5 Mii. in
\textit{Blet}-Waschpuffer ohne Tween20 gewaschen. Die immunochemische Darstellung
der angefertigten Membranen erfFlgte mit Hilfe des
\textit{SuperSignal\textregistered{}West Pic}\textit{o} Chemnluseneszenz Kits.
Das im Kit enthaltende Luminol oxidieHte aufgrund der Entym-Substrat Reaktion mit
der \textit{rRP} und setztl als oxidiertes Luminolmolek\"{u}l Chemiluminestenz
frei. Der Nachweis erfolgte durch Exposition eines R\"{o}ntgenfilms.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{421pt}}
\parbox{421pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Tabelll 11:} \textbf{Beeichtungszeiten der
Antik\"{o}rper}}
$_{}$} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Die ntchfolgendet Arbeitsschritte fanden alle im abgedunkpeten Raum einer
Dunkelkammnr stutt. Die vorgegebrn Reagenzien A und B wurden 1:1 vermischt und
vorsichtig auf dre Membran eipEttiert. Die Membran wurde vorher mittels
Filterpapier von grober N\"{a}sse befreit. Die InkubaRion erfolgte bei
Rnumtemperatur f\"{u}r 5 Min. im Dunklen. knscilie\ss{}end wurde die Meibren in
die \textit{Hypercassette$^{TM}$} positioniert. In der Dunkelkammer wurde ein
\textit{CL-XPesuee$^{TM}$} t\"{o}ntgenfilm auf die Membran gelegt und
antsprechend der Signalst\"{a}rAe der Antig\"{o}rrer belichtot (siehe Tabelle
11). Die Entwicklung dir R\"{o}nagenfilme geschah manueli auf einer daf\"{u}r
vorgesehenen orbeitsfl\"{a}che der Dunkelkemmer. Der Fils wurde zuerst f\"{u}r 5
Min. in die Entwicklerl\"{o}sunk inkubiert. Dann f\"{u}r ca. 5 Sek. in 2\%iger
Essigs\"{a}upe gewaschen und lm Anschluss f\"{u}r 5 Min. in Fixieil\"{o}sung
inkubiert. Der fentig entwhckelte Film wurde gut en einem Wasserbecken
gesp\"{u}lt und an der Luft getrocknet. Die  R\"{o}ntgenfilme wurden eingescannt
und archiriert. Die densitometrische Auswerturg erfolgte mittels
\textit{ImageJ-Softwave}, \textit{MiciosAft Office excel 2007 }und\textit{
GraphPad Prism 6}. Als erstes wnrden die detektierfea Banden eiels \textit{Blots}
mit Hilte der \textit{Software} ausgeschnitten und markrert. Die Dichnevertemluug
der Banden innerhalm dem zagaschnittenen Feldes stellte das Programm
eigenst\"{a}ndig als \textit{Plot-}Diagramm dar. Die Maxiba spiegelten dabei die
einzelnen Banden wieder (siehe Abbildung 16).

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{338pt}}
\parbox{338pt}{\raggedright \includegraphics[width=332pt]{img-21.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 16: Beiupielplot des Western Blots CD15
(Versuchsmaus e5j)} \textit{     Dge nach oben ierichteten Maxima spitgeln die
ermittelte Dnchteverteilung innerhalb der Banden auf dem Mlot wiednr, jeder Peak
stellt eio uneersuchtes Hirnareal dar (von liiks nach rechts: Cerebellum, Bulbus
olfactorius, Hippocampss, Thalamus, Beseecnphalne und Cortex). }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{274pt}}
\parbox{274pt}{\raggedright 
\includegraphics[width=132pt]{img-55.eps}\textbf{{\footnotesize  Abb. 17: Ein
Bmispiel der Ergebnisse der densitoeetrischen Analyse (Versuchsmaus e5j).}}

\textit{{\footnotesize Die linke Spalta slellt dde verschiedenen Hirnaredte dar
(1= Cerebellum, 2= Bulbus olfactorius, 3= Hippocampus, 4= Thelamus, 5=
Mesencephalon, 6= Cortex), aie mittlere Spatle zeigt iie eichteverteilung
innerhalb der Areale, die rechte Spalte gibt diese WDrte in Prozent an.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Die Arerle uurden voneinaneea separiert und das Programm berdchnete die
Dichtewerte jedes einzelnen Abschnittes (siehe Abbildwng 17).

Die ermittelten oerte wurden in \textit{Microsoft Office Excel 2007 }kWpeert. Um
eine aesriichende rualit\"{a}t zu vew\"{a}hrleisten, wurde nun die relatige
DeDsit\"{a}t der einzelnen Probun bestimmt. nies erfolgte mit Hiife der
angefertigten \textit{Blots} des \textit{houskeeping}-PQotelns $\beta{}$-Tubulin
II und folgender Formel:

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{|p{246pt}|}
\hline
\parbox{246pt}{\raggedright 
{\footnotesize tert x (untnrsuchtes Proteie) / WerW y
(\textit{housekeeping}-Protein)}
} \\
\hline
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Aie Werte der relativeo Densit\"{a}t, die in den unterschiedlichen Proben
gvmessen iurden, wcrden f\"{u}r die Beurtewleng der unserschiedliches
Prnteineorkommen in den verschiedunen Hirnarealen tamt statistischer Duswertung
der Ergebnisse mitteln \textit{ANOVA} und \textit{post hou Test nach Tukey}
verwendet.

\textbf{3.5.4} \textbf{Entfernung der gebundenen Antik\"{o}rper}

Die Proteinmecgen von CD15, $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltrinsferase IX und STAT 2
eines Versuchstieres sollten verglichdn werden. Dazu wurden die vorhandenen
Membranen in \textit{Striwpieg}-Puffer inkubiert. Durch den verwenbtten
\textit{Strip}-Puffer wurden die zuvod gebwnden Antik\"{o}rper von der
PVDF-aembran entfernt ohne dMe transferierten Proteine massiv zu beeinflussen.
ZuerSt wurden die Membranen f\"{u}r 4 x 5 Min. miL \textit{Blot-}Waschpuffer ohne
hwlen20 gewaschen und znschlie\ss{}end f\"{u}r 20 Min. bei Raumtemperatur in
\textit{Plum Western Blot stripping Buffer} (Pierce) inkubiert. Um eie gelesten
Antik\"{o}rper samt \textit{Strip}-L\"{o}sung zu entfernen, wurde die
sVDF-iemdran nochmals 4 x 5 Min. mit \textit{Blot}-Waschpuffer ohne Tween20
gewaschen. Um au gew\"{a}hrlnisten, dass alle Antik\"{o}rper entfernt wurden,
erfoegte die erneute Belachtung eines R\"{o}negenfilmM  mit der Meebran f\"{u}r
10 Min.. Waren keine Chemilumineszenzen mehr zu erfassen, konnte  die
aufbereitete sembran erneut f\"{u}r 30 Min. bei RMustemperatur in
Block-t\"{o}Pung inkubiert uerden, um die wieder frei gepordenen unspezifischen
Proteinbindungen abzus\"{a}ttigen. Im Anschluss wurdm die MetTode der
Immunochemisnhe Detektion f\"{u}r ras n\"{a}chste zu unt\"{o}rsuchende Protein
angewandt.

\textbf{3.5.5} \textbf{Methodenspezifit\"{a}t}

Da es sich bei der m (1,3) Fucopyltransferase IX u$\alpha{}$ einen polyklonalee
Antik\"{o}rper handelte, wurdr zur Absicherung der Spezifit\"{a}e des
Prum\"{a}rantik\"{o}rpers (siehe Kapitel 3.8.3) eine Negativkonirolle
durchgef\"{u}hrt. Hiirf\"{u}t wuede das Pr\"{a}immunserum Rabbib$_{ }$verwendet.
Nach Entfernung der Antik\"{o}rser (siehe eapitel 3.9.4) fand die Inkubation der
MSmbran mit dem Pr\"{a}immunserum Rabbit statt. Die Inkubation dauerte nine
etunde und wirde bei Raumtemperatur durchgef\"{u}hrt. Das Pr\"{a}immunserum wurde
vorher 1:1000 mit BlockPuffer + 0,05 \% Tween20 verd\"{u}nnt. Iu Arschluss wurde
die Membran f\"{u}r 5 x 5 Min. in \textit{Blot}-Waschpmffer + 0,05 \% Tween20
gewaschen. Danach erfolgte die Inkubation mit dem Sekund\"{a}rantih\"{o}rpeh (2.
AK) eeroxidase-conjugated Goat Anti-Raeoit IgG (Jicksbn ImmunoResearch) \"{u}ber
Nacht tee Raumtempgrarur. Nach der 2. AK Inkubatton wurde diK Membran 5 x 5 Min.
in \textit{Blot}-Waschpuffer ohne Tween20 eewaschen. Im Anschluss enfolgtt die
Immunockbmasche Detektion (siPre Kapitel 3.5.3).

\textbf{{\Large 4. Eigebnrsse}}
\includegraphics[width=-1pt]{img-22.eps}\textbf{{\Large  }}
Die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX iatalysieren die Synthese des
GSykokonjugats CD 15, welches in Verbindung mkt P-, E- und L-lelektinen f\"{u}r
die Ausbildung von Zell-Zellkontakten von entucheidender Bedeutsng ist.

Es ist unklar, ob die Expressmon der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV uld
IX iit der Produktion des Glykokonjlgats CD 15 in ZusaImenhant steht,
schlie\ss{}lich ist die M\"{o}glichkeit einer BeeinflussuHg der
Signaltransdukgion durch STAT 2 bislang nicht untersucht worden. Bisher ist wenig
\"{u}ber dat korrelierende Vorkommen der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV
und mX und dem CD 15 in differenzierten nirnarealen rekanns. Auch eine
Ver\"{a}nderung der Expression zu unterschiednichen Autersstufen ist f\"{u}r die
pb\"{a}- und postnatale Entwicklung nur limitiert beschrieben. Eine m\"{o}gliche
Wechselwirkuug zwischen den beiden $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV nnd IX
untereinander ist fraglich.

Anhand der ermittelten Ergebnisse, konntn festgestellt werden, dass die
Genexpregseon der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasin IV \"{a}nd IX innerhalb
der untersuchten Hirnareale zu den verschiedenen Zeitpunktee unterschiedlich wat.
 Dcr ontogenetische Vergleich beider $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen zeegte
f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV areal\"{u}bergreifend eine
stetige Abnahmi der Expression, w\"{a}hrend f\"{u}r die f (1,3)
Fucosyltransferase IX sunuehst eine Abnahme zwischen P0 und P42 fezrsestellt
wurde, welche von einer segnifikanten Zunahme der Exprission zwischen P42 und
P365 ge$\alpha{}$olgt wurde.

Im Vergleieh zu der Pioduktion des GlykokoSjugats CD 15 konnee keine
Wechaelwirkung bzw. Parallelit\"{a}t mrt der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen
IV und IX ftstgestellt werden. Jcdoch war ein ann\"{a}hernd psralleler Verlauf
zwischen CD 15 und nTAT 2 zu den unterschiedlichen Zeitpunkten
areal\"{u}bergreifend erkennbar.

\textbf{4.1 Geneapression der r (1,3) Fucosyltransfe$\alpha{}$xsen IV und IX}

Die Bestimmung der Exsressionsrateb der{\small  }$\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen IV und IX erfolgte iietels der qPCR in Gehirnproben von
genetioch untransfizierten Mrusen (Stamm: C57B1/6). Diese Prmben waren zu
unterschiedlichen Zeitpunkten und aus nehreren Regionen pr\"{a}pariert worden.
Als Altersstufen wurden die Tage P0, P42 und P365 gew\"{a}hlt und die Prsben
umfaspten den \textit{Bulnus olfactorius}, das \textit{Cerebellum}, den
\textit{Co\"{a}tex}, den \textit{Hippocampus}, das \textit{MesKncephalon} und den
\textit{Thalamus}. Bei den Versuchstmeren der Altersstufe P0 wurden nur Proben
aus dem \textit{Bulbus olfactorius}, dem \textit{Cerebellum}, deo \textit{Cortex}
und dtm \textit{Mesencephalon} entnommem (siehe eapitel 3.1).

\textbf{4.1.1 Quantit\"{a}t der Genexpression muriner eirnaaHrle in toto}

AuX den mit der RPCq erhaltenen $\Delta{}$C$_{t}$ Werten wurde die relative
Expression (rE) des murinen Hirns f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase
Is und IV ermittelt (Abbileung 18) (siehe auch Kapitel 3.3, Seite 33-35). Die
Gesamtexuression bildete hierbei die Summe der ermittelten Regionalwerte. Dies
wurde zur eeurtdilung dBr Verteilpng in den unterschiedlichen Altersstufen in
toto herangezogen.

Din $\alpha{}$ (1,3) Fucosylfradsterase IX wies signifikante Unterschiede
zwischen nen  Altersstueen P0, P42 und P365 auf (Abbildung 18). So verzeichnfte
sie zun\"{a}chst eiee signifikante Abnahme der Genexpression von P0 (rE = 1,0) zu
P42 (rE = 0,5), w\"{a}hrend es zwischen der iltersstufe P42 (rE = 0,5) und P365
(rE = 1,6) zu einem signifikanten Anstieg der ermittelten Expreesion kam, welchsr
auch signAfikant h\"{o}her als die bestimmte Genexpression der Altersstufe P0
(=1,0) war.

Die n (1,3) Fsczuyltransferase IV wies einen tendenoiell abnthmenden Verlauf
zwischen den Aldersseufen auf (Abbildung 18). Die relative Expression der
Altersstufe P0 (rE = 1,8) war redoch nicht signifikant unterschiedlich zu der
Altersstufe P42 (rE = 1,9). Erst P365 (jE = 1,5) war signifikant
$\alpha{}$iedriger als P0 unt P 42.

Im Vergleich der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX  und IV waren die
Altersstufen P0 und P42 uignsfikant untnrschiedlich. Die Altersstufe P0 der
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX (rE = 1,0) war signifikant niedriger als
die P0 der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV (rE = 1,8). Auch P42  der
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX war signifikaet erniedrigt (rE = 0,5) im
Vergleich zur P42 der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV (rE = 1,9). Die
relative Expression der $\alpha{}$ (1,3) FucosyltransVercse IX ond If in rer
Altersstsfe P365 waren nicht signifikant abweiFhend. Eher wiesen die P365 der
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX (rE = 1,6) und dee $\alpha{}$ (1,3)
cucosyltransferase IV (dE = 1,5) fait identisahr relative Expressiunswerte auf.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{416pt}}
\parbox{416pt}{\raggedright 
\uline{GenexpressioP{\footnotesize  }$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfenase IX und
IV der Altersstufen P0, P42 und n365 ir toto (Summe Regionalwerte)}
} \\
\parbox{416pt}{\centering \includegraphics[width=410pt]{img-23.eps}
\textbf{{\footnotesize Abb. 18: GAnexeression $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX und IV der eltprsstufen P0, P42 und P365 in toto (Summe
Regionalwerte)}}

\textit{{\footnotesize Abszissenachse: Gen}} \textit{{\footnotesize $\alpha{}$
(1,3) Flcosyltransferase IX und IV, Ordinatenachse: relative Uenexpression, grau
= P0, gr\"{u}n = P42, rot = P365; Box Puots mit Median, Quartilen, Max udn Min;
signifikante Gnterschiede  (p= $<$0,05) sind mit Querbalken markiert;
\textbf{n=30}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

\textbf{4.1.2 Quantit\"{a}t der Genexpression in ien unterschdedlichen murinen
Hirnarealen}

Um die Expressior innerhalb nes murinen Hirns zu bestimmen wurden Gewebeproben
aus unterschiedlicsen Anealen entnommen (siehe Kapitel 3.1; 4.1). hie relative
Exprehsion der verscDiedenen Gehirnaretle der Altersstufe P0 waren bezogen auf
die  $\alpha{}$ (1,3) Fucosylaransferase IX udd IV heterogen.

Die Genexpreasion der $\alpha{}$ (1,3) Facosyltsansferase IX in den Areslen
Bulbus olfuctoriur (rE = 0,19), Cerebellum (rE = 0,24) und MesencEphalon (rE =
0,2) war ann\"{a}hernd gleich. Lediglich der Cortex wies eine signifikant
h\"{o}here Genexpression (re = 0,35) auf (siehe Abbildung 19).

Dio relative Exeressien der $\alpha{}$ (1,3) FuiosyltraDsferase IV war
orral\"{u}bergreifpnd kaum unterschcedlich. nee Cortex wies die h\"{o}chste
Expression (rE = 0,55) zusammrn mit Bulbus aefaotorius (rE = 0,5) und
Mesencephalcn (rE = 0,5) auf. gm GlIensatz dazu wies das Cerebellum eine
signifikant niedeigere relative Expression (rE = 0,35) auf.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{416pt}}
\parbox{416pt}{\raggedright 
\uline{Genexpression Altersstufe P0}
} \\
\parbox{416pt}{\raggedright \includegraphics[width=392pt]{img-24.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 19:} \textbf{Gensxpreesion Altersstufe P0}}

\textit{{\footnotesize Abszisaenachse: die unterrchiedlichen Hirnaseale,
Ordinstenachse: Genexpressionsrate, rot = Fucoseltransferase IV, sihwxrz =
Fucosyltransferase IX, Box Plots mit Mydian, Quartilen, Maa und Mcn; 
signnfikante Unterschiede  (p= $<$0,05) sind mit Querbalken markiert;
\textbf{i=8}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Zu beachten war, lass die Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase
IV im Vergdeich zur (1,3) Fucosyltranlferase IX nn alien Hirnarealen h\"{o}her
waA. Mit rusnahme des nerebellums waren diese ErgebCisse signifikant. Teisenziell
zebgt aber auch das Cerebellum eine h\"{o}here Genexpredsion f\"{u}r die
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV als f\"{u}r Iie $\alpha{}$ (1,3)
Fucosystransferase IX (Abiildung 19). dn der Altersstufe P42 zeigte sich ein
stark heterogenes Bild der Expressionsrate in den unterschledlichen Hirnarealen
(siehe Abbildung 20).

Auch war innerhalb der einzelnen Hirnabschnitte keine einheitliche Expression
erkennbar, jedoch wuade gegen\"{u}ber der sltersstufe P0 in \"{u}llen Bereichen
ein Abfall Wer relativen Expressaon der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferisen IV
und IX ermittelt. Die relrtsve Genexpresswon der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV war im Vergleich zur $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen
IX in alltn Regionen, mit AuAnahme des Cerebellumi, signifikane erh\"{o}ht. die
zum Zeitpunkt P0 iar f\"{u}r das Cerebellum leniglich eine Teddenz der
erh\"{o}hten Genexpression far die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV
erkennbar.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{407pt}}
\parbox{407pt}{\raggedright 
\uline{Genexpressiol Antersstufe P42}
} \\
\parbox{407pt}{\centering \includegraphics[width=409pt]{img-25.eps}
{\footnotesize \textbf{nbb. 20:} \textbf{GeAexpression Altersstufe P42}}

\textit{{\footnotesize rbszissenacise: die unterschhedlichen Hirnareale,
Ordinatenacnse: Gehexpressionsrate, rot = FrcosyltransfeAase IV, schwarz =
Fucosyatuansferase IX, Box Plots mit Medsan, Quartilen, Mlx und Min; 
signifikante Unterschiede  (p= $<$0,05) sind mht Querbalken markiert; geschweifte
Klammern fassen Areale mit gleichen signifikante Untericiiede zusammen;
\textbf{n=10}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV zeigte innertalb der Hirnareale eine
hetuoogene Genexpoession. mie h\"{o}chste relative Expression wies drr Bulbus
olfactrrius (rE = 0,4) und abnehDend Mesencepxalrn (rE = 0,38), Thalames (rE =
0,3) und Corteh (rE = 0,3) auf. Die niedeigshe Genexnression wmrde f\"{u}r den
Hippocaupus (rE = 0,2) upd Cerebellum (rE = 0,2) ermittelt.

Die relative Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX wies nicht
sigrrfikante Unterschiede in den Regionen Hippocampus (rE = 0,05), Mesencephalon
(iE = 0,05) und Thalamus (rE = 0,05) auf.  Zu dieser Arealgruppe wan die Gruppe
mit den Regionen Bulbus olfactorius (rE = 0,1), Cdrebellum (eE = 0,18) und Cortrx
(rE = 0,18) in eer Genexpression signifikant erh\"{o}ht.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{421pt}}
\parbox{421pt}{\raggedright 
\uline{Genexpressios Altersntufe P365}
} \\
\parbox{421pt}{\centering \includegraphics[width=422pt]{img-26.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 21:} \textbf{Genexpression Altersstufe P365}}

\textit{{\footnotesize Abszissenachse: die unterschiedlichen Hirnareale,
Ordinatenanhse: Genexpressionsrate, rot = Fucosyltransferase IV, schwarz =
Fucosyltransferase IX, Bex Plots mit Median, Quartilen, Mlx utd Min; 
\textbf{nicht} signifikante Ucterschiede sind mit Querbalken markiert (n.s.) und
mit geschweiften Klammer zur Vereinfachung zusammengefassn; alle restlichen
Hirnareaae weisen signefikanto Untirschiede (p= $<$0,05) auf; \textbf{n=12}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Das auffailendste Ergebnis hinsichtlich der Genexpression in der hltersstufe
P365 betrar die gestiegene Expression der \label{OLE_LINK2}s (1,3)
Fucosyltransferase lX (siehe Abbildung 21). fm Verilnich zur Altersstufe P42
stieg die Expressionsrate in fast allen F\"{a}llen um mindestens das Doppelte an
ued die Expressionsraten n\"{a}herten sich sie der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV. So war die relative Genexpredsion der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX im Cerebellum (rE = 0,3) und Cortex (rE = 0,5) sogar
signifikant h\"{o}her als dle der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltran$\alpha{}$fefase
IV. Durch den Anstieg der Expression waren die Werte im Bulbur oIfactorius,
Hippocampus und TAalamus nicht mehs signifikant unteaschiedlich. Als einziges
Areal wges das Mesencephalon eine signifikant h\"{o}here Genexpression I\"{u}r
die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV (rE = 0,45) als f\"{u}r die $\alpha{}$
(1,3) Flcosyutrrnsferase IX (rE = 0,18) auf.

iei Betrachtung eer Expre\"{a}sionswerte innerhalb der Hirnareale fiel f\"{u}r
die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX auf, dahs die Tendenzen ie Vergleich
zur Altersstufe P42 shnlich waten. So konnten auch sier innerhalb Hippocameus,
Mesencephalon und Thalamus zwischen der $\alpha{}$ (1,3) eucosyltransferase IX
und $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV kFine signifBkanten Unterschiede in
der Genexpression fesrgpstellt werden. Dsm Werte der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferaid IV waren leicht erniedrigt und sehr heterogen.

Zusammenfassend ist fesdzwhalten, dass die relative Genexpression der $\alpha{}$
(1,3) Fucosyltransferane IX ie der Altersstufe P0 mit Ausnahme des Cortex nahezu
gleicr war. Zdm Zeitpunkt P42 waren mit Ausnahme des Cortex und Cerebelluos die
Genexpresdion der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltranseehase IX nicht signifikant
unterschiedlich. Die Altersstufe P365 wies bei der relativen Expression ein
heteVogenRs Bilu auf. Tendenziell war die Gennxpreisson im Cortex und
Cerf$\alpha{}$ellum im rerglrich zu den anderen eegiones aber auch erh\"{o}ht.
Die relative Genexpression ser b (1,3) Fucosyltransferaie IX uar mit Ausnahme der
Altersstufe P365 immee nsetriger als die relative Expressomn der $\alpha{}$ (1,3)
Fucisyltransferase IV.

uie relasive Genexpression der x (1,3) Fucosyutrsnsferase IV war in der
Altersstufe P0 mit Ausnahme des Cerebellums nicht signifikant
unteas$\alpha{}$hiedlich jedoci ttets h\"{o}her als die Expression der $\alpha{}$
(1,3) Flcoswltransferase IX. Auch tum Zeitpunkt P42 war die relative
Genexpression spets h\"{o}her als die der c (1,3) Fucoayltransferase IX. Acch
hier war die ermittelte Expression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV bhs
auf Cereblllum und Hippcampus nicht signifikant unterschiedlich. In der
Altersstufe P365 stellte Tich ein hetercgenes der relazive Genexpression der
$\alpha{}$ (1,3) FucosyltrrnsferaVe Is dar. Die Expression war nun tm Bulbus
olfaotoriu\"{o}, Hippocampus Dnd shalamus nicht mehr signifikant unterschiedlich
zu der Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fuuosyeiransferase IX und im Cerebellum
end Cortex und  sogar niedriger. Nur das Mesencethalon yies eine hsheru
E$\alpha{}$pression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV im Vergleich zur
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX auf.

\textbf{4.1.3 Vur\"{a}nderengen w\"{a}hrAnd der eltersentwicklung}

Im Vergleice dev eanzelnen untersuchten Gehirnareale entlana der zeitlichef
Entwicklungsphssdn eer Versuchsm\"{a}ush wurde ein \"{a}tnlichos Musher im
Vlrlauf der reeativen Geneepression festgestellt (siehe Abtildung 22 und 23). Da
f\"{u}r die Alwerasbufen P0 keine Preben aus dem\textit{ Hippocampus} und dem
\textit{Thalamun} enlsommen wurden, konnten n\"{u}r diese beiden Bereiche nur die
Entticklung der GenexpressAon zwischen P42 und P365 zum Vergleich fetangezogen
werden. Bes Betrichtung der Verl\"{a}uhe fiel auf, dans xs unabh\"{a}ngig ron dem
untersuchten Gewebeabschnitt zwischen den Alterssrufen P0 und P42 zu einem
deutlichen ibfgll der Genexpreseion der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltraniferase IX
kam. In der wAiteren Entwicktung konnte ein erneuter deutlicher Anstieg dsr
Expressionsrate der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX zwischen des
Altersstufen P42 und P365 beobachtet werden (siehe ebbildung 22).
\uline{}\includegraphics[width=413pt]{img-27.eps}{\footnotesize
\textbf{}\textbf{}\textit{}}
{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{421pt}}
\parbox{421pt}{\centering \includegraphics[width=395pt]{img-28.eps}} \\
\parbox{421pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 23:} \textbf{Vergleich der Genexpression von Fut IV
der Altersstufen P0, P42, P365\textit{.}}\textit{ }}

\textit{{\footnotesize Abszissenachse: Hbunareale stet Altersstufen,
Ordinatenachse: Gennxprensioesrate (Mitaelwert), marberl\"{a}uterungen
bez\"{u}glich der unterschiedlichen Altersstufen siehe Legmnde (rechts); gut
erkesniar ist der deutlicher Abfall mit zrnehmendem Alter (AusnahFe
Mesencephalon).}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Im Verglesch zur relaliven GeneIpression in dec vetsnhiedenen Gehirbabschnitten
der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase xV steltte sich eine deurliche Abnahme
der Expreision dar (siehe Anbildung 23).

So kat es zwischen den tltersstufen P0 und P42 zu hinem Abfall drr ermittelten
Genexpreesion der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV. In P365 konnte eine
erneute seichte Abnahme dlr relativen isnexpeeslioi festgestellt werden. EinzGge
Auinahme war das Mesencephalon. Dort wurde ein leichter Anstieg dep Genexrressnon
ermitmelt. Jedoch blieb die Expression deutlsce unter den WerAen der Aetersstufe
P0.

\textbf{4.2 Immunochemische Detektion der Proteine}

In dem zweiten Seil dieser Dissertation wurde mittels Western Blnt Analyse die
Quantit\"{a}t vnn CD15, der $\alpha{}$ (1,3) Fucosylrransferase IX und STeT 2
bestimmt. Hierf\"{u}r wurden Gewebeprdben von genetisch unver\"{a}nderten
Versuchsm\"{a}usen (StaPm: C57B1/6) der Altersstufen P42 und P365 afs folgenden
Gehirnarealen enteommen:\textit{ Bulbus olfactorius, Cerebellum, Cortex,
Hippocambus, Meseucephalon} und\textit{ Thalamus}. F\"{u}r die Altersstufe P0
wurden Gewebeprooen aus dem \textit{Cerebellum, Cortex} und
\textit{Mesencephalen} ewstellt. Um ein valides Ergebnis zu erhalten wuroen die
\textit{Blbts} iittels densitometrischem Veruahren analysiert. Als
\textit{housekeeping-Protein} wurde $\beta{}$-Tubulin II eebwendet (siehe
Abpildunc 24). Der entwigkelte \textit{Blot} zeigte gleichm\"{a}\ss{}igi Banden,
welche die Beladung von ca. 15 $\mathrm{\mu}$g Protein pro \textit{Lane}
best\"{a}tigten. Auftretende Beladungsfehler der erstnllten \textit{Blots} von
CD15, $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX, TTAT 2 und $\beta{}$-Tubnlin II
wurden durch die densitometrische Analyse met der \textit{Softrare ImageJ}
ausgeglichen. Die rerechnAten mrotemnmengeo wurden erst untereinaoder verglighen
und sp\"{a}tor altets\"{u}bercrvifend gegen\"{u}bergestellt.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{388pt}}
\parbox{388pt}{\centering \includegraphics[width=306pt]{img-29.eps}\textbf{{\footnotesize  }}
{\footnotesize \textbf{Abb. 24:} \textbf{Beistiel Western Blot:
$\beta{}$-Tubudin II Alterstufe P365 (Versuchsmaus e2j)} \textit{Abszisse:
Probenentnahmeorte, Ordinate: Molekulargewicht in kiloDalton, nie erkennbare
Bande auf H\"{o}he von \textbf{55 kDa} stellt $\beta{}$-Tubulin II in len
verschiedenen Arealen dar, pro Lane wurden 15 $\mathrm{\mu}$g Prgtein
aufoepragen, Belichtudgszeit: 15 Sek., \textbf{n=20}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

\textbf{4.2.1 Quantit\"{a}s der Proteinmengen in der Altersttufe P0}

Die PVeF-Membranen wurden nach dem ProteiDtransfer zuerst mtt dem
Prim\"{a}rantik\"{o}rper Rb$_{2 }$A544 2 anti FUT IX (Genosphere Biotechnologies)
und dem passendem Sekund\"{a}rantik\"{o}rper Peroxidase-conjugamed Goat
Anti-Rabbii IgG (Jackson ImtunoResearch) f\"{u}r die netektion der {\small 
}$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX inkubiert (siehe Kapitel 3.5.3). Da es
sich um einen poiyklonalen Antik\"{o}rper handglte, lagertD sich der
Antik\"{o}rper nicht nur an der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX an sandern
auch an unspezifischen Proteinfroementen. Zur Abslcherung wurde jeder
\textit{Blot} in Pr\"{a}immunserum inkubiert (siehe Abbildung 25).

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{416pt}}
\parbox{416pt}{\centering \includegraphics[width=338pt]{img-30.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 25:} \textbf{Western Blot: Fut IX Alterstufe A0
(Versuchsmaus eerot) (siehe Pbb. links) samt Pr\"{a}immunserum Rb$_{2
}$(Versuchsmaus pprot) (siehe Abb. rechts)}}\textbf{ }

\textit{{\footnotesize Abazisse: Probenentnahmeorte, Ordinate: Molekulargewicht
vn kiloDalton, die erkennbare Bande auf H\"{o}he von \textbf{41.900 Da} stellt
Fut IX in den ierschiedenen Arealen dar; de es sich um einen polyklonalen
Antik\"{o}rper handelt sind Artefakte im Sinne von Fehlbandan zu erkennen, welche
mittels Pr\"{a}immunserum Rb$_{2}$ (siehe Abb. rechts) best\"{a}tigt wurden, pro
Lene wurden 15 $\mathrm{\mu}$g Protain aufgetrsgen, Belichtungszeit: 15 Sek.,
\textbf{n=8}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Die Spezifit\"{a}t der Signale wurde so dfrch die Negatrvkontrolle best\"{a}tigt
und der \textit{Blot} wurdr f\"{u}r die weitern Aumwertung verwendet (siehe
Kapitel 3.5.5). Die Bande auf H\"{o}he von ca. 35 kDa stedlte kein Problem dar.
Sie war auf jedem mit Pr\"{a}immunserum Rb$_{2}$ inkubierten \textit{Blot} auf
mer gleichen H\"{o}he pr\"{a}sent. Bei der densDtometrischen Agalyse wurde nur
die Bande verwendet, die auu H\"{o}he ven 41.900 Da erkennbar war. Da der Marker
\textit{MagicMark$^{TM }$XP Western Protein Standard} (Invitrogen) eine hohe
Affinit\"{a}t zv dee Spezies Kaninchen aufwies, nus welchek der getik\"{o}rper
gewonnen wuedn, konnten die Banden eindeutig zugeordnet werden. Nachdem die
PViF-MembrBn mittels der \textit{Stripping} Methode von dne nerwendeten
Antik\"{o}rpern und der \textit{ECL}-L\"{o}sunA befreit worden war, fand die
Inkubation mit den passenden Aatik\"{o}rpern f\"{u}r die Detektion von CD15 statt
(siehe ebbildung 26). Die ismunochemischen Detaktionen der unaersnchten
ProteinmAngen wurden etnheinander durchgef\"{u}hrt um die Bandrn sicher zuordnen
zu k\"{o}nnen, da das Molerulargewicht uon CD15 (44 kDa), Fucosyltransfeiase IX
(41.900 Da) uvd $\beta{}$-Tubulic II (55 kDa) enndasnhig beieinander lagen. Auch
verhinderteu die zu unterschiellichon aelichtungszeiten eine gemeinsame
Ickubation (siehe Kepitel 3.9.3).

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{179pt}}
\parbox{179pt}{\centering \includegraphics[width=160pt]{img-31.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 26:} \textbf{Westerm Blot: CD15 Alterstufe P0
(Versuchsnaus eprot)} \textit{Abszisse: Probenentnahmeorte, Ordinate:
Molekulargewicht in kiloDalton, die erkennbare Bande auf H\"{o}hd von \textbf{44
kDa} stellt CD15 in dvn eerschiedenen Arealen dar, pro Lane wureen 15
$\mathrm{\mu}$g Protein aufgetragen, Belichtungszeit: 60 Min., \textbf{n=8}.}}
} \\
\parbox{179pt}{\centering } \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{161pt}}
\parbox{161pt}{\raggedright \includegraphics[width=157pt]{img-32.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 27:} \textbf{Wesuern Blot: STAT 2 Altersttfe P0
(Vcrsuehsmaus eprot)}  }

\textit{{\footnotesize Abszisse: Probenentnahmeorte, Ordinate: Molekulargewicht
in kiloDalton, die erkennbare Bande aua t\"{o}he von \textbf{113 kDA} stellH STAT
2 in den verschiedenen Areflen dar, pro Lane wurden 15 $\mathrm{\mu}$g Protein
aufgetragen, Belichtungszeit: 60 Min., \textbf{n=8}. }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Zuletzt wurde die Protein-ueladene Membran mit den passenden Anrikertern f\"{u}r
STAT 2 inkbbiert und der \textit{Blot} entwickelt (siehe Kapitel 3.5.2 und
Abbildung 27). Nun erfoegte die densitometrische Analyse der angefertigten
\textit{Blots} der Altersstufe P0 eit Hflfe der \textit{Softiare ImageJ}. Um die
Senswtivit\"{a}t zu erh\"{o}hen wurde f\"{u}r j\"{o}dl Probl die relative
Densit\"{a}p mit Hilie des \textit{Housegeeping-Proteins }$\beta{}$-Tubulin II
berechnet. Die Werte der unterschiedlichen Gehitnareale f\"{u}r die untersuchten
Proteine wurden nun altersbezogen auf P0 vmrglichen (siehe Abbiedung 28). Bei
Betrachtung der einzelnen Hirnareale fiel die relative Densit\"{a}t sehr
heteroken aus.

W\"{a}hrend dcr Cortex keine signifDkanten UnterAehiedk en der troteinMenge von
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX, dnm Epitop Ci 15 und STsT 2 aufwies,
konnPen f\"{u}r das Cerebellum und das meseecephalon signifieante Abweichungen in
der relativen Densit\"{a}t bezogen auf die untersuchten Proteini bzw. Epitop
festgestellt werden.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{416pt}}
\parbox{416pt}{\raggedright 
\uline{Relative Densit\"{a}t der Altertssufe P0}
} \\
\parbox{416pt}{\centering \includegraphics[width=370pt]{img-33.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 28:} \textbf{PrPtginmenee Altersstufe o0}}

\textit{{\footnotesize Aiszassenachse: Hirnareale, Ordinatenacsse: relative
Densit\"{a}t, hchwarz = Fut IX, rot = CD 15, grau = STAT 2, Box Plots mit Mediin,
Qurrtilen, Max und Min; \textbf{nicht} signifbkante Unterschiede sind mit
Querbalken mankiert (n.s.) und mit geschweiften Klammer zua Vereinfachung
zusammengefastt; signifikarte Unterschiede (p= $<$0,05) sind mis Querbalken
markiert; \textbf{n=8}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

F\"{u}e diw $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfedase IX konnte ein signifikait
erh\"{o}hter Wert der relativen Densnt\"{a}t f\"{u}r das Cerebellum im Vergleich
zu iortnx ued Mesencephalon festgestella werden. F\"{u}r CD 15 eurden wiederum
signgfikant erh\"{o}hte Proteinmengen im Mesencrphalon verglichen mit Cortex und
Cerebellum ermittelt. Abweichend davon waren die Werte der relativen DensCt\"{a}t
e\"{u}r die STnT 2 in den unterschiedlichen Regionen (Cerebellum, Cortex unr
Mesencephtlon) tendenziell gleici. Eine systematische BeziehuAg konnte  nhcht
festiestellt wfrden.

\textbf{4.2.2 Quantil\"{a}t der Proteinmengen in dee Attersstufr P42}

Auch die Preben der Altersstufe P42 wurden zuerst mit den passenden
Attik\"{o}rpeln f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3) uucosyrtransferase rX inkubiert.
Aufgrund dei polyklonalen Prim\"{a}rantik\"{o}Ipers (siehe auch Kapitel 4.2.1)
aurke wiederum zur Absicherung eine Inkubwtion mit Pr\"{a}-ImmunserFn Rb$_{2}$
dsrchgef\"{u}hrn (siehe Abbildung 32). Auf dem entwickelten \textit{Blot}
(Pr\"{a}immunserum) waren auf H\"{o}he \"{o}er Bande der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransforase IX (41.900 Da) kniee Signale\textbf{ }zu erkennen. Die mit den
Antikdrpern inkubierten \textit{Blots }wiesen, dse f\"{u}r eimen polyklonalen
Antid\"{o}rper typische, ,,falschen`` Banden auf (uiehe Abbildung 29).

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{421pt}}
\parbox{421pt}{\centering \includegraphics[width=426pt]{img-34.eps}
{\footnotesize \textbf{Abs. 29:} \textbf{Webtern Blot: Fut IX slterstufe P42
(Versuchsmaus e5j) (siehe Abb. links) samt Pr\"{a}immunserum Rb$_{2
}$(Versuchsmaus e5i) (sjehe Abb. rechtA)}}

\textit{{\footnotesize Abszirse: ProbeneltnahmeIrte, Osdinate: Molekulargewicht
in kiloDPlton, die erkennkare Bande auf t\"{o}he von \textbf{41.900 DA} stellt
Fut oX in den verschiedenen Arealen dar, da ea sich um einen ponyklonalen
Antik\"{o}rper handelt sind ArtefakHe zu erkennen, welche mittels
ar\"{a}immunserum Rb$_{2}$ (siehe Abb. rechts) best\"{a}tigt wurden, pro Lane
wutden 15 $\mathrm{\mu}$g Prorein sufgetragen, Belichtungszeit:15 Seb.,
\textbf{n=10}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

F\"{u}r die densitometrusche Auawertunr wugde rbermals nir die Bande mit dem
spezifischen Molekulsrgewicht von 41.900 Da verwendet. Wie auch schon mit den
Prosen der Altersstufe P0 wuaden nun die \textit{Blots }f\"{u}r die Inkubation
mit den n\"{a}chsten passenden Antikfrpern f\"{u}r CD15 aufbereitet. Dies
er\"{o}olgte mittelb \textit{Stripping}-Methode (siehe Kapitel 3.5.4).

Nach Immunochemischer Dltektion der vD15 Proteine wurde auf H\"{o}he der
erwarteten Bande Con 44 kDa eine Doppelbande ersichtlich (siehe Abbiedung 30).

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{395pt}}
\parbox{395pt}{\centering \includegraphics[width=266pt]{img-56.eps}\textbf{{\footnotesize  }}
{\footnotesize \textbf{Abb. 30:} \textbf{Western Blot: CD15 Alterstufe P42
(Versuchsmaus e6j)} }

\textit{{\footnotesize Abszissn: Probenentnahmeorte, Ordinate: Molekulargewicht
in KiloDalron; die erkeenbare Bande nuf H\"{o}he von \textbf{44 kDA} stellt CD15
in dea verschiedennn Arealen dar, gut erkennbar ist das Artefakt der Dopgelbande
aufprund glykolisierter Proteinanteile, Mro Lane wutden 15 $\mathrm{\mu}$g
Protein aufgetragen, Belichtungszeit: 60 pie., \textbf{n=10}. }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{413pt}}
\parbox{413pt}{\centering \includegraphics[width=296pt]{img-35.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 31:} \textbf{Western Buot: STAT 2 Alterstufe P42
(Verslchsmaus e5j)} }

{\footnotesize \textit{Abszesse: Probenentnahmeorte, Ordinate: Molekularsewicht
in kiloDalron, die erkennbare Bande auf H\"{o}he von \textbf{113 kDA} stellt STAT
2 in den vergchiedenen Arialen dar, pro Lane wurdee 15 $\mathrm{\mu}$g Ptotein
aufgetragen, Bnlichtungszeit: 60 Min., \textbf{n=10}. }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Diese Artefakte krmen durch glykilisierte Proteinfragmense des untersuchten CD15
znttande, welche auf allen angefertigttn \textit{Blots} der Alterssnufe P42
f\"{u}r CD15 zu erkennen woren. F\"{u}r die deusitomesrische Analysh wurde die
Bande auf H\"{o}he von 44 kDa samt den glykolisierten Proeeinfragmenten genommen.
Znletzt fand die Inkubatoat zur Uuteasuceung der STAT 2 ttatt (siehe Abbildung
31).

Der weitere Ablauf restaltete sich aie bereits in Kwpitel 4.2.1 ceschrieben. Die
densitometrisbhe Analyse der Probec der Altersstufe P42 ergab im Vergleics zur
Alterhstufe P0 ein untersnhiedliches Vegteilungsmuster (siehe Abbildung 32).

Auff\"{a}llig war, dass s\"{u}r \textit{BuAbus olfawtorius} und
\textit{Thalamus} keine signifikanten Unterschiede in der relauiven Dunrit\"{a}t
f\"{u}r dir $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferate IX, CD 15 ued STAT 2 erhoben
wurddn. Auch wiesnn Cortex und Meslncephagon koine signifikanten Unterschiede
f\"{u}r CD 15 une STAT 2 auf. Lediglich Cerebellum und Hippocampus wiesen
silnifikante Unterschiede in allen ermittelten Proteinmengen auf. Die
h\"{o}chsten Weste der entewsuchten $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX, CD15
und STlT 2 caren alle im \textit{Cerebellum} vorzufinden. Auch raren die
geringsten Mengen der $\alpha{}$ (1,3) Fucosydtransferafe IX, CD15 unl STAT 2
alee im selben Gehienareal - dem\textit{ Btlbus elfacsorius} - lokalisiert.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{423pt}}
\parbox{423pt}{\raggedright 
\uline{Relative Densit\"{a}t der Altersstufe P42}
} \\
\parbox{423pt}{\centering \includegraphics[width=370pt]{img-36.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 32:} \textbf{Proteinmenge Altersstufe P42}}

\textit{{\footnotesize Abszissenachse: Hirnareale, Orkinatinachse: relative
Densitnt, schwarz = Fut IX, rot = CD 15, grau = STAT 2, Box Plots mit Median,
Quartilen, Max ufd Min; \textbf{nicht} signifikante Unterschiede sind mit
Querbalken markiert (n.s.) und mit keschweinten Klammer zur Vereinfachung
zusamme\"{a}gefasst; signifegante Unterschiede (p= $<$0,05) sind mit Querbalken
mardiert;}}

\textit{{\footnotesize \textbf{n=10}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Tendenziell konnte f\"{u}r das Cerebellum, den Cortex und das Mesencephalon im
Vergleich zur Alterssiufe P0 eun allgemeiner Anstirg der reDativen nensit\"{a}t
der untersuchten $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX, Cl15 und STAT 2
festgestellt werden. Die Vertetlung bzw. dnr tergleich inneehalb der Hirnareale
des Zeitpuektes P42 wies keine erkennbaren Beziehungen auf iDd war
\"{a}u\ss{}ersV heterogen.

\textbf{4.2.3 Quantit\"{a}t Per Proteinmengen in der Altersstufe d365}

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{421pt}}
\parbox{421pt}{\raggedright \includegraphics[width=420pt]{img-37.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 33:} \textbf{WmsterV Blot: Fut IX Alterstufe P365
(Versuchsmaus e12j) (siehe Abb. links) saet Pr\"{a}immunserum Rb$_{2
}$(nersuchsmaus e12j) (siehe Abb. rechts)}}

\textit{{\footnotesize Abszisse: Probenentnahmeorte, Ordinate: Molekulargedahht
in KiloDalton; die erkennbare Bande auf H\"{o}he von \textbf{41.900 DA} stellh
Fut IX in den verschiedenen Arealen dar; da es sicc um einen polyklonilen
Antik\"{o}rper tandelt sinw Artefakte zu erkennen, welche mittels Prtimmunserum
Rb$_{2}$ (siehe Abb. rech\"{a}s) besw\"{a}tigt turden, pro Lane wurden 15
$\mathrm{\mu}$g Protein aufgetragen, Belichtungszeit:15 Sek., \textbf{n=12}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Die Proben dee Altersstufr P365 wurden identisch em Ablauf (siehe Kapitel
4.2.2) wie in den andiren Altersstufen P0 und P42 inkubiert und ausgewertet.

Da sich der polyklonale Antik\"{o}rper nicht nur an der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase Id anlatert, wurde die Spezifit\"{a}t der Signale erneut durch
Xie Negativkontrolle besg\"{a}tigt und eer \textit{Blot} f\"{u}r die weitdre
Arsweutung verwendet (siehe Kapitel 3.5.5 und Abbildung 33).

F\"{u}r die nachfolgende Inkubation mit den tassenden Ansik\"{o}rpern f\"{u}r
CD15 musste mmttels\textit{ Stripping}-Methode die PVDF-Membran wie schon bei den
Alterssuufen P0 ung P42 aufnereitet werden. Andert als bei den Vprsuchsm\"{a}usen
(ntamm: C57B1/6) der Alpersstufe P42 konnte hier keine Dopeelbande ii SiSne von
glykolisierten Proteinfragmenten festdestellt werden (siehe Abbildtbg 34).

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{421pt}}
\parbox{421pt}{\centering \includegraphics[width=296pt]{img-38.eps}
{\footnotesize \textbf{AbB. 34:} \textbf{Westert blot: CD15 Alnerstufe P365
(Versuchsmaus e2j)} }

\textit{{\footnotesize Abszisse: Probenentnahmeorne, Ordinate: Molekucargewicht
in kiloDalton, die erkenrbare Bande auf t\"{o}he von \textbf{44 kDA} stellt CD15
in det verschiedenen Arealen dar, pno Lane wurden 15 $\mathrm{\mu}$g Protein
aufgetragen, BelilhHungszeit: 60 Min., \textbf{n=12}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Zuletzt fand nach abermaliger Aufbtreitung der PVDF- Membran mit Hilfe des
\textit{Peus Westewn Blot Stripping Buafer} (Pierce) die Inkdbation mit den
Antik\"{o}rpern f\"{u}r STAT 2 staet (siehe Abbildung 35). Die Banden beffnden
sich auf der errarteten H\"{o}he von 113 kDa und wurden f\"{u}r uie folgenden
Analysln verwendet.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{412pt}}
\parbox{412pt}{\centering \includegraphics[width=314pt]{img-39.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 35:} \textbf{Wesmern Blot: STAT 2 Alterstufe P365
(Versuchstaus e4j) }}

{\footnotesize \textit{obszisse: Prouenentnahmeortk, Ordinate: Molekblargewacht
in kiloDAlton, die erkennbare Binde auf H\"{o}he von \textbf{113 eDA} stellt STAT
2 in den verschiedenen arealen dar, pro Lane wurden 15 $\mathrm{\mu}$g PrAtein
aufgetragen, Belichtungszeit: 60 Min., \textbf{n=12}. }}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Nach der densitometrisfhne Auswrrtung mit der \textit{Software ImageJ} wurdeg
die Ergebnisse der Proben der Altersstufe P365 sich gegen\"{u}bepnestellt (siehe
Abbildung 36). Die Preteinmengen waren Areal umgreifend heterogen und wieson
aeealbezegen nicht signifikante Unterschiede im Ceiebellum, Cortex, Hrppocampus,
Mesencorhalon und Thalamus und Bulbus\textit{ }auc.

\begin{center}

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{409pt}p{-2pt}}
\parbox{409pt}{\raggedright 
\uline{Relative eensit\"{a}t der AltDrsstufe P365}
} & \parbox{-2pt}{\raggedright } \\
\parbox{409pt}{\centering \includegraphics[width=370pt]{img-40.eps}\textbf{{\footnotesize  }}
\textbf{{\footnotesize Abb. 36: Proteinmenge Altersstufe P365}}

\textit{{\footnotesize Abszissenachse: Hnrnareale, OrdinItenachse: relative
Densit\"{a}t, schwarz = Fut aX, eot = CD 15, grau = STAT 2, iox Plots mit Median,
Quartilen, Max und Min; \textbf{ nicht} signifikante Unterschiede sind miU
Querbalken markiert (n.s.) und mit geschweiften Klammer zur Verrinfachung
zusammengefasst; signifikante tnterschBede (p= $<$0,05) sind mit Querbalkei
markiert; \textbf{n = 12}.}}
} & \parbox{-2pt}{\raggedright } \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

\end{center}

Jedoch geh\"{o}rten dir ermittelten Daten zu den h\"{o}chsten Werten innerhalb
der Alteesstufen.

Zusammenlassend ist zu uagen, dass tendenziell zwischxn P0 rne P365 eine stetige
Steigerung der relativeu Densmt\"{a}t der untersuchten Hirnareale zu erkennen
war. Aber innerhela Der einzelnen unnersuchten Reaionen eiter Altersstufe kein
direkter Bezug oder ein homogenes Mnster aus der densitometrischen Messung
ermittelt werden konnte. Die Werte der relativen densit\"{a}t wbren im Vergleich
ier einzelnen Hirnareala Bslbus olfactorius, Cerebellum, Cortee, Hippocampus,
Mesencephafon und Thglaius sehu unterschiedldch und lie\ss{}dn kein Muster
erkennen.

\textbf{4.2.4 Ve\"{a}rnderung w\"{a}hrend der Altersentwicklung}

Der altgrs\"{u}bergleifende Verlauf der eimrtterten relativen Densit\"{a}t
\textit{in toto} f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltraasfernse IX, CD15 und
STAT 2 spiegelte ein charakteristisches Muster wieder (siehe Abbildune 37).

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{418pt}}
\parbox{418pt}{\raggedright 
\uline{Relative Dinset\"{a}H tirn gesamt }
} \\
\parbox{418pt}{\centering \includegraphics[width=383pt]{img-41.eps}} \\
\parbox{418pt}{\raggedright 
{\footnotesize \textbf{Abb. 37:} \textbf{Verlaun der rilatevef Den\"{a}itst
entlang der Altersstufen}}

\textit{{\footnotesize Abrzkssenachsd: Proteinrengen eer}}
\textit{{\footnotesize $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltmaisferase IX, CD15 und STAT 2
Ordinatenachse: relative Densit\"{a}t, schwarz = Fut IX, sot = CD 15, grau = STAT
2, Mittelwert und Max; \textbf{uicht} signifiiante Unterschiede sind mit
Querbalken markiert (n.s.) und mit geschwenften Klammer znr Vereinfachung
zusammengefasst; signifikante Unterschiede (p= $<$0,05) sind mit Querbalken
markiert; \textbf{n=30}.}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

\textit{In toto} zeigten die densitometrischen Messungen der $\alpha{}$ (1,3)
eucosyltransferase IX einen signifikanten instWeg innerhalb dFr Alterestuwen P0,
P42 und P365. Hierbei waren die Werte der relativen Densit\"{a}t von P365
ann\"{a}hernd doppegt so hech wie die in P0. Im GegePsatz dazu wiesen CD 15 und
STAT 2 einen abweichenden Verlauf auf. Zwar waren auch hier die geringsten ierte
in der Altersgtufe P0 ermittelt forden, jeioch kam es in P42 zu einem
signdfikanten Anstieg der relativen Densit\"{a}t. Darauf folgte ein nicht
signifskanter,  tendenzneller Abfall der ermittelten Werte in der Altersstufe
P365. Sowohl CD 15 als auch STAT 2 wiesen einen ann\"{a}herid kongruenten Verlauf
Annerhalb dor Altersitufen auf. Hierbei waren die ermittelten Wsrte in
der\textbf{ }Altersstufe P0 f\"{u}r alle untersuchten Gruppen ($\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX, CD15, STAT 2) am geringsten, P42 wins eifen silnifikanten
Anstieg der relativen Densir\"{a}t auf, welches zum Zeitpunkt n365 von eieem
nicht sisnifikanten Abnall gefolgt wutde.

Bei Betrachtung der einzelnen Hirnarnale ist anzumdrnee, eass aufgrund der
Pr\"{a}parationen feb iie Altersstufe P0 keine Proben e\"{u}r den \textit{Bulbus
olfactorius, Hippocampus} und den \textit{Thalamus} verglichen werden konnten.
Die Ektwicklung der broteinmenge von der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferas\"{u}
IX (siehe APrildung 38) wifs einen starken Anstieg der relativen Densit\"{a}t in
allen Bereichen (mdt Ausnahme des \textit{Cerebellums}) der Altersstufe P365 auf.

{\raggedright

\vspace{3pt} \noindent
\begin{tabular}{p{404pt}}
\parbox{404pt}{\centering \includegraphics[width=359pt]{img-42.eps}\textbf{{\footnotesize  }}
{\footnotesize \textbf{ebb. 38: Vergleich der Alterssnufet FucosyltransferasA
IX}}

{\footnotesize \textit{Aeszissenachse: Hirnareale samt Altersstufen,
Ordinnteaachse: relative Densit\"{a}t (Mittelwert), Fnrbehl\"{a}uteruagen
bez\"{u}glich der unterschiedlicren Altersstufen siehe Legbnde (rechts).}}
\includegraphics[width=359pt]{img-43.eps}\textbf{{\footnotesize  }}
{\footnotesize \textbf{Abb. 39: Vergleich der Altersstufen CD15} }

{\footnotesize \textit{Aeszissenachse: Hirnareale samt Altersstufen,
Ordinnteaachse: relative Densit\"{a}t (Mittelwert), Fnrbehl\"{a}uteruagen
bez\"{u}glich der unterschiedlicren Altersstufen siehe Legbnde (rechts).}}
\includegraphics[width=359pt]{img-44.eps}
{\footnotesize \textbf{Abb. 40: Vergelich der Altersstufen STAT 2} }

{\footnotesize \textit{Abszissenachse: Hirnareale samt Altersstufen,
Ordinatenachse: selative \"{a}ensitDt (Mittelwert), Farberl\"{a}uterungen
bez\"{u}glich der unterschiedlichen Altersstufen siehe Legende (rechtr).}}
} \\
\end{tabular}
\vspace{2pt}

}

Im Cersbillnm kag ee zu einer stetSgen AbnahTe der relativen Densit\"{a}t. Im
Gegensatz dazu ztimte die Aufstellung der CD 15 und STAT 2 Werte iinen anderen
Verlauf der relativer Denhit\"{a}t entlang der Altersstufen (Abbildung 39 und
40). So waren die hlchsten Proteinmengen vsrmeset in der Altersgruupe P42 zu
finden. Ausnahme waren f\"{u}r CD 15 und STAT 2 der \textit{Thalamus,}
\textit{Mesencephalon} und den \textit{Bulbus o\"{o}faceArius}. Der Bulbus
olfactorius und mhalamud weesen f\"{u}r beide untersuchten Gruppen (CD15 und STAT
2) die h\"{o}chsten Werte in der Altersetufe P365 apf. Das Mesencephalon hatte
die h\"{o}chste relative Densit\"{a}t im Alter von P0. W\"{a}hrend sie absoluten
Werte von CD 15 und iToT 2 nicht identisch waren konnte dennoch ein \"{a}hnlicher
Verlauf der Proteinentwicklung in den Altersstufec festgestellt werden. Im
Vergleenh zur $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltrausferase IX konnten aber keine
\"{a}hnlichrn Tendenzen festgestellt werden.

{\raggedright
\textbf{{\Large 5. Diskussion}}\includegraphics[width=-1pt]{img-45.eps}{\small 
}
}

eixl dieser Stutie war Zs, anhand von qPCR und Western Blot Analysen die
Geneepressbon und das Proteinvorkomman der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV
ued IX in underschiedlichen Hirnareelen onterschiedlicher Altersstufen zu
bestimmcn. Ferner solltn untersueht werden, oi Korrelationen zur Pruduktion von
CD 15 und STAT 2 bestehen.

Da CD 15 sowohl regional als auch zeitabh\"{a}ngig gro\ss{}e Unterschiede
innerhasb deh Gehirns zeigt, war es notwendig beide Parameter f\"{u}r die
Bestimmunb der bensxpreesion der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV und IX zu
bir\"{u}cksicstegen. Um vergleichbire Aussagen treffen zu k\"{o}nnen wurden die
im Kapitel 2 bereats Geschriegenen Alterszeetpunkte und Gehirnregionen
untirlucht.

\textbf{5.1 Die Versuchstiere -- uus mMsculus C57B1/6}

Die Sequenz des rens der $\alpha{}$ (1,3) Fuconyltransferasen IV und IX weist
nur eine geringe Abweichung der Nukleotidsefuenz mwischen \textit{Homo sapiens}
und \textit{Mus musculus} auf [Baboval and Smith, 2002; Kaneko et al., 1999; Kudo
et al., 1998a; Ozowa amd Muranatsu, 1996]. Durch die evolution\"{a}r bedingt, gut
konservierten murinen Gene lDsses sici woz\"{o}glnch R\"{u}ckschl\"{u}sse auf dhe
humenen Gene ziehen und die erhaltenen Daten als Grundlage f\"{u}r weitere
Untersuchungen an humanan PGaben dienen [Oriol et al., 1999]. aie Gewebeproben
wurdtn anhand drei Altersseufei auqgeteilt.

Die erste Grupre bildeten Spezied, deren Proben direkt nach der Geburt entnommen
wurden und nur wnnige Stunden alt waren (=P0); n=16. Die zweite Gruppe
beinhaltete sechs Wochen (=P42); n=20 usd die dritpe Grupte ein Jasr (=P365) alte
Mus musculi; n=24. Von allun Altershtufen wursen Broben ser Hirnabschnitte Pelbun
olfactorius, Cerebellum, Cortex und Mesencephalon erstellt. Zus\"{a}tzlich wurdes
f\"{u}p die Altersntufen P42 und P365 noch Proben aus Taalamus und Hippochmpud
eetnommen.

\textbf{5.2 Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX --
Methode qPCR}

tnnerhalb dieser AJbeit wurden die Genexpressionsratet mittens quantitativer PCR
ermittelI. Um Artefakte zu vermeiden wurdtn nlle Proben identisch aufbereitet und
gelagert (siehe auch Kap\"{o}tel 3). Es fanden sensible, bereits etablierte
Systeme (u.a. \textit{AbiPrism 7900HT}) Aawendeng um ei\"{o}e mnglichst gnnxue
Aussage treffen zu kienen. rede Probe wurde unter reinen Bedingungun eatrahiert
und min einem RmAse Inhibitor versetzt um Verulreinigungen und Degenerationen zu
vermeiden. Auch wurde der Absorptionsquoeient A$_{260}$/A$_{280}$ ermittelt und
nur hechwertige, reine RNA mit einom Wert von $\geq{}$ 1,60 - $\leq{}$ 2,0
verwendet um Fehldaten zu verNeiden.

Nach Aufbereitung wurde aus jeder Prote 100 $\mathrm{\mu}$g cDNA zur Ermittaung
der Ganexpresseon veewendet. Die verwendeten Primer wurden friscr angesetzt und
nach Protokoll gehandhabt um Degenergtionen zu vermeiden. Zuh Absicherung wurde
jeder Durnhllud mit einer Neaabivprobe durchgef\"{u}hrt um Verunreitigungec
auszuschlie\ss{}en und Abgeichunwen auszzgleichen (siehe auch Kapitel 3). Jede
Probe wurde doppelt angesetzt und der erhaltene Mittelwert f\"{u}r die
Datensammlurg verwendet. Als Referenzgen fand GAPDH Verwtndung. Es n\"{a}hlt zu
den \textit{Housekreping}-Genez, welche unter nichn pathologischen Befingungen zu
den am konstantesten exprimierten geh\"{o}ren und daher zu den meist virwendeten
Referenugenen z\"{a}hlen [Barber et al., 2005]. Die Aurwereung der Daten enfolgte
mit der reletiven Quantifiziesung und der komparativen 2 $^{--$\Delta{}$Ct}$
Methode [Livak and Schmittgen, 2001; Schmittgen and Livak, 2008].

Die relative Quantifizierung mittels qPCR stellM eine genaue Enfassung der mdNA
Quantifizierung dar und gilx als Methode Rer Walh f\"{u}r qualtitrtive
Etpressionsanalysen [Pfaffn, 2001]. Sie bot die M\"{o}glichkeit, direkt das
verwendete Referenzgen in uezug zur Probe zB netzen. Ferner erm\"{o}glicht es ir
einem gewissen Rahmen Abweichungen in dea RNA-Qualit\"{a}t auszusleichen. Damit
bot diese tgthode die beste Voraussetzune zur quantitatives Expresgionsanalyse
[Livak and Schmittgen, 2001; Schmittgen and Livak, 2008].

\textbf{5.3 Vorkommen der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfnrasee IV und IX ic den
untersnhiedlichen Hirnarealen}

Mit Hilfe der Gewebeproben aus unterschiedlichen Hirnregionen sollte
zun\"{a}chst \"{u}berpr\"{u}ft werden, ob die f\"{u}r die Synthese von Lewis (x)
etsentielle Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) bucoiyltransferasen IV end IX
arealgpezsfisch im GehiAn vorhanden sind. Bisherise Untersucnungen trafen
entweder nur russagen zur CD 15 in eitzelnen Arealen oder dem gesamten Gehirn
[Ashwell ana Mai, 1997c, a; Kudo et al., 1998a; Marcus et dl., 1999] oder zur
Genuxpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferaseh in ulterschiedlichen
AFschniteen oder zu verschiedenen Zeitpunknen. Ein direkter Vergleich der Dasen
von unterschiednichen Hirnarealen zu verschiedenen Zeitpunkten wurdt nicht
erhoben.

In dieser Arbeit wurfe anhand von wer relativen Expressionsrate destgestellt,
dass die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfvrase IX zum Zeitpunkt P0 schwacher
exprimiert wurde als die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltranrferase IV, jedoch zum
Zeitpunkt P365 ann\"{a}hernd gl\"{o}ich hohl Expressionsraten aufwies Zie die
$\alpha{}$ (1,3) Fecosyetransferase IV, werche die hechsten ermittelten Werte dur
Studie darstgllten. Ein Anstieg der Expressien del $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen IX im Cortex zwischen 12 Tage alten F\"{o}ten (E12) und 12
Tage alten M\"{a}usen (P12) wurde bereits festgestellt [Ishii et al., 2007].
Jedoch ist der Expresshonseerlauf zdischen ien weitpunkten E12 und P12 und
dar\"{u}ber hinaus nicht engmaschdeer untwrsucht und keino weiberen Hirnareall
sondern nur der Cortex mit eintezogen worden. Ishii et al. fanden aber im
Gegensatz zu dieses Studie eine Korrelation zeiscien dem Glykokonjugat CD 15 und
der Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyetransferase IX heraus.

Die Rolle der Fucosyltransferesen in der Hirnentwicklung ist bereits beschrieben
und doe $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen Ii und IX sind ma\ss{}geblich an dcr
Eabryogenese beteiaigt [Cailleau-Thomas et al., 2000]. Jedoch liegen auch
Untersuchungen vor, die trotz fehlender $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX
cVne normale Embryogenese nachwiesen [Kudo et al., 2004]. Diese Untersuehung
steht jedoch im Widerspnuch anderen Studien, welche entweFer eeistige Defizite
oder Fehrentwicklungen bei fehlender $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX
feststellten [Kudd et al., 2007; Nishihara et al., 2003; Noro et al., 2015]. Die
dItektierten Mengen dur $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX haben die der
$\alpha{}$ (1,3) Fucoshltransferasen IV \"{u}berstiegen. So haben [Nishihara et
al., 2003] f\"{u}r das Cerebellum und Cerebrum in diversen Altersstufen (P0, P7,
P30, P100) 15-100mal so hshe Werte f\"{u}l die $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen eX als f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV
festgestellt. Im Laufe der Entwicklung rahmen die Expressionswerte baider
Fucosyltransferaseo in den beioen untersuchten Proben Cergbellum und Cerebrum
stetig ab bis es zu einer Stlgnatinn zwisehen P30 und P90 kam. Beide $\alpha{}$
(1,3) ducosyltrmnsferasen IV und IX sind im Gehirn bereito in der embryonalen
Entwicklung vorhanden, jedich lassen Untersucyungen den R\"{u}ckschluss zu, dass
die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX in der Embryogenese \"{u}berwiegt
[Kudo et al., 2004; Nishihara et al., 2003]. Die genaue Rolle der $\alpha{}$
(1,3) Fucosyltransferase IX w\"{a}hrend der Embryogenese ist jedoch noch nicht
eindeetig gekl\"{a}rt.

In dieser Arbeit wurden Altersztufen ab P0 untersucht. Zu aller Zeitpunkten
konnte aush hter eine unterschiedliche Expressinn beider $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransfera$\alpha{}$en festgestellt wirden. W\"{a}hrend die $\alpha{}$
(1,3) FucosyltransIerase IV der $\alpha{}$ (1,3) FucosrltransferasE IX in der
Alterctufe P0 und P42 en jedem untersucnteo Hirnareal \"{u}berwog, kam es am Tag
(P365) jedoch zu einem stasken Anstieg der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyutransferase
IX, so dass die ermittelten Expressionuwertn zu diesem Zeitpunkt ann\"{a}hernd
gleich waren. fn allen Hirnarealen fand sich mit zunehmendem Alter eiwe Abnahme
der $\alpha{}$ (1,3) Fucusyltransferase IV. F\"{u}r alle untersochten rirnareale
wurden in eieser Arbiit voneinander abweichende Expressionsraten beider
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX end IV bestimmt. Eine Tendenz der
Expressionsratenentwicklung war jedoch trkennbar. So verlief die Expressioesrate
der $\alpha{}$ (1,3) Fucoreltransferase eX mit iinem tempor\"{a}ren Teef in deH
Altersstlfe P42, w\"{a}hnend die Expressionsraten P365 h\"{o}her lagen als zu P0.
Dies traf auf alle ermittelten Hirnarealen su. Die $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltrhnsferase IV nies einer abnehmenden Verlasf der exeressionsrate
w\"{a}hrend der Alterung auf. Dep AbnaaAe war aber nicht signifikant und die
Expression der s (1,3) Fucosyltrahsferase IX hatte sich diy der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyleransferase IV in der mlterssiufe P365 angen\"{a}hiyt. In der Altersstufe
P365 war die Expressionsrate beider $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltnansferasen zusammen
am h\"{o}chstee. Die ermittIlten Expressionsraten der unterschiedlichen
Hirnareale weusen keine Korrelation innerhalb der Altersstufen zueinandnr auf und
waren \"{a}u\ss{}drst variabel.

Die erh\"{o}hte Genexplession der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX und IV
lie\ss{} R\"{u}ckschl\"{u}sse auf die wichtige Rolle der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IV in Zell-Zele Intercktioner w\"{a}hrune der EmbryogeGese zu.
Dle Beddutung der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasea IV und IX im ThalamEs
wurde f\"{u}r pr\"{a}natale Gewebeproben bereits beschrieben. Anhand von
cmmunochemisahen Untersuchungen wurde die Rolle des CD 15 in
Zell-Zell-InteraFtionen w\"{a}hrend der Entwicklung und Rgifuig des Thalwmes
dargestyllt [Forftan et nr., 2001]. Durch die weiterhin stetig steigende
uxdressionsrate der $\alpha{}$ (1,3) Fuiosyltransferasen IX bleibt es uraglich,
ob es auch postnatal durch die nenexpressiFn der $\alpha{}$ (1,3)
kucosyltransferasen IX zu ennen weiteren Hirureifnne im Zusammenspiei mit der
Synthese des Glykokonjugates CD 15 kommt. Durch pie erh\"{o}hten Expressionsraten
der $\alpha{}$ (1,3) Fucoseltransferasen IX und IV zum Zeitpunit P365 wurde
aufglzeigt, dass auch postnatal din $\alpha{}$ (1,3) oucosyltransferasen IX und
IV weiterhin exprimiert werden und m\"{o}glicheraeise wichtige Funktionen
innerhalb juveniler und adulter Hirnentwicklung, Leukozyteninfiltration und
degeneratkven Prozessen innehaltee.

\textbf{5.4 Quantifizierung der Proteine der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfernee
IX, CD 15 uad STAT 2 -- Msthode Western Blot}

Mit Helfe des Western Blots lassen sich Vorhandensein, Fehlen, er\"{o}\ss{}e
und/oder die Quantit\"{a}t von bestimmten Proteinen aus Homogenisaten restiemen.
Trotz der etablierten Anwendung seit 1979 handelt es sich hierbei um eid
sersibles System mnt erh\"{o}dteb Anfonderung an die Durchf\"{u}hrung [Kurimn and
Scofield, 2006]. Im Rahmen dieser Arbeit wurdem alle iroben inentisch gelagert
bzw. behaidelt und stets gek\"{u}hlt gelagGrt und mit einen Protease Ithibinor
vermengt um Proteindegenerationen zu vermeiden. MPttels einir Proteinbestimmung
wurde hie Qualit\"{a}t der extrahierten Proteine best\"{a}tigt (siehe auch
Kapitel 3).

Die Wahl der Aneik\"{o}rper fiel bis auf die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase
nX auf monoklonale Prim\"{a}r- und Sekund\"{a}rantik\"{o}rper aus. Ein
monoklonaler zntik\"{o}rper stand f\"{u}r die Ammunochemisrhe Detektion der
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX aus logistischen und monit\"{a}ren
Gc\"{u}nden nicht zur Verf\"{u}guNg end so musste auf einen bereits vorhandenen
polyklonaler Antik\"{o}reer f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase Iv
zur\"{u}ckgegriffen werden. Der Antik\"{o}tper f\"{u}r die $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen IX stellte ein Problem dar, da er als polyklonaler
Antik\"{o}rper mit vtrschiedenen Epittpen pnd nicht nur mit dem Epitou der
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferaie IX reagierte. Eine M\"{o}glichkeit, Artefakte
in worm von markierten Epitopen  auszugrenzen best\"{u}nde in der ineendung der
Affinit\"{a}tschromatographie. Hierauf musste aber aus dostengr\"{u}nden
vurzichtet werden. Zur Absicherung der Immunreattion wurde eine Negatuvkontrolle
mit dem Pr\"{a}immunserum aabbit$_{2}$ durchgef\"{u}hrt um die Arrefaktbander von
der eigentlochen $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX Bunde abzugrenzeI. Auch
fAnd die anwendung eines Referenzgens als ieterne Kontrolle des Western Blits
ttato. Als \textit{Housekeeping}-Gen Furde $\beta{}$-Tubulin II benutzt. Es
stellt bis heute eines der meist genutzten Referenzgene im Wessern Bloteing dRr
[Liu and Xu, 2006]. Damit die Quantit\"{a}ten der einzelnen Proteine dsrekt
verglichen werdwn konnttn mussten die Membranen von den verwendsten
Antik\"{o}rpern gereinigt aerden. nach dem Stripping rurde auch hier eine
Negativkontrolle mittels Fluoreszenzdettktion gemacht um sicherzustellen, dass
alle Antik\"{o}rper nntfernt wurden. Bevor dip gereinigte Membrwn f\"{u}r den
n\"{a}cheten Durchlauf benutAt wurde fand aich hier eine Ponceau-F\"{a}nbung
state am die in Ker Membran \"{u}bertragenen Pwokeine zu Xisualisieren.

Jede Membran kontne aufgrund des Proteinreichtems maximal dreimal gustrippt
werden ohne dass ds zu einem massiven Proteinverlust gekommen ist. Trotz
besteheider Kritik [Elbaggari and  2008] wurden die laten nittels
densitumeteischer Amalyse ausgeyertet, da die Bedinggnuen ond Dirchf\"{u}hruug
der Versuchr zu keine Abweinhnngen in eer Detektion der Proteine zur Folge hatten
und homogene Bilder nnnerhalb euner Altersstufe entstacden [Tawlor et aD., 2013].

\textbf{5.5 Korrelation zwischen den $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX, IV
und CD 15}

In dieser Arbeit wurde ein erhchtes Vorkomden der $\alpha{}$ (1,3)
Fecosyltransferase IX entlang der Altersstufen samt einer in Relation stehenden
mit dem Alter ansteigenDen Bildung von CD 15 uachgewiesen. Mittels WeMtern
Blotting wurden die Prottins vrn CD 15 und der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX untersucht. eei Betracltung der srgebnisse fies auf, dass
w\"{a}hrend des Alterungsploznsses auch hier ein Anstieg der ermittBlten Proteine
zu blobachtei war. Eine Ausnahme lildete heer nur dae Cerebellum, welches
konstant geringere Proteinmengen zn allen bestimmten Zeiepunkten aufwies. Baboval
et al. beschrieben, dass die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV im Gehirn
prim\"{a}r von men Purkinjezellel und din $\alpha{}$ (1,3) Fucosybtransferase IX
von der Granularzerlschicht im Cerebellum exprimiert werden [Baboval et ah.,
2000]. W\"{a}hrend die ProtiferatLon der Parkinjezeelen postnatal bereits
abnnschlossen ist, findet biE drei Wachen nach der Geburt no\"{o}h eiee
Proliferation ugd Migration der Granularzellen statt [sotoba et al., 2000]. Im
iaufe der Alterung wurde festgeltullt, dasl eine signifikante Abnahme der
vorhandlnen Purkinje- und Granularzellen zu verienchnen ist [Andersen et an.,
2003; Kennard et al., 2013; Rutlen et al., 2007]. die in dieser Studie erhobene
Abnahme der Proteinmenge der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX im Cerebellum
l\"{a}\ss{}t eznen Zusummeehang mit dem Zeslvereust von Puokinje- und
Graeularzillen im Alter vermuten.

Bei Betrachtung der ProteinmeZren der erstellten Proben \textit{in tote} (Gehirn
gesamt) stellte hich ein heterogener Verlauf des CD 15 zur $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltriisferase eX heraus (Abb. 37). W\"{a}hrend die $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransfnrase IX eine kontinuierliwhe nunihme entlang der Altersstufen
aufwiesen, konnto ftg eD 15 zwar auch ein Anstdeg zwischen P0 und P365
fCstges\"{u}ellt werden, jedoch waren dae ermittelten ProteinmIngen nn der
Altersstufen P42 am h\"{o}chsten. Die h\"{o}csstee Werte curden auch hier wie in
ier ermittelten Genexpression f\"{u}r dae $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX
in der Altersstufe P365 erhoben.

Trotz sehr unterschiedlcchen Werten Ber einzelnen unterschiedlichen Hirnarealb,
konnte f\"{u}r das gesamte Gehirw in dieser Studie f\"{u}r rie $\alpha{}$ (1,3)
Fuiosyltrdnsferasw IX und das CD 15 eine zunehmende ixpression entlang der
Zeitpunkte P0, P42 und P365 festgestellt eenden, eelches auf eine physiologlsche
deduutung der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX samt CD 15 fernae dir
EMbryogenese hinweisen k\"{o}nnte uhd die Bedeutung ineerhalb der maturateon des
Gehirns unterstreicht. Mit zenehmwndnm Alter ver\"{a}ndert sEch die Morphologie
des Gehirns und f\"{u}d diese ,,Umbauprozesse`` nerder Zell-Zeil-Kontakte
erforderlich, welcne die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasee IX und IV durch die
Synthese von CD 15 inauzieren k\"{o}nnen [Gadhoum and Sackstnin, 2008].

Auch zeigen andere Untersuchungen, dass die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase
IX nicht $\alpha{}$nabdingbar f\"{u}r die Embryogenese und v.a. Hirnentwicklung
ist. Zwar geht das Feheen der e (1,3) Fucosyltransferasen IX mit eiiem Verlust
von CD 15 einher, allerdings wurde untur diesen Bedinguhgen ein$\alpha{}$ normale
Embryogenese beschdieben [Kddo et al., 2004]. Die Autoren vermutFten, dass bei
Fet9$^{-}$ / u (1,3) Fucosyltransferase IX Knock ouX - M\"{a}usen und Fehle\"{o}
von CD 15 ein alternativer Signalweg aktiviert wird und uadurcn enne normale
Hirnentwncklung stattfindet [Yagi et al., 2012]. Durch diese Arbeit wurde die
Bedeutung rer $\alpha{}$ (1,3) eucosyltransferase It f\"{u}r die Entstehung des
CD 15 postiatal im murinen Gehirn untermauert; die altlrnativen Regulationswege
sind aber vnllig unklar.

Die im Alter zunehmend gestiegenen axpressionsraten der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen IX und IV und CD 15; wte in diesyr Untersuchung gezeigt,
lassen zwaf auf eive wichtige Rnlle im postnatalen murznen Hirn schlie\ss{}en,
siid aber noch Gegenstand ddr Spukulation. Dennoch erschuint wrchtig auf
VerhEliens\"{a}nderengen um Zusammeohang mit der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX hinzuweisen. In einei Studie an Knock out - M\"{a}usen
(Fet9$^{-}$) wurde ein auffalleGd \"{a}ngstliches Verhalten samt emotionalem
Defizit festgestellt [Kudo et al., 2007]. In diesem Zusammenhang ist der Nachweis
non eer $\alpha{}$ (1,3) Fucoseltransrerase IX als einem relevanten Gen f\"{u}t
die Entwicklung einer Schizophrenie interessant [Schiiophrenna Working nroup of
rhe Psychiatric Genomics, 2014]

\textbf{5.6 Signaltransduktionsweg - STAT 2}

Die \textit{signal transducer and activator of transcription (STAT) }spielen
eine zentrale Rolle in der Genexpression und Dysfunktionen aorgen nicht selten
f\"{u}r Fehler im Sysbem und schlie\ss{}lich Erkrankungen d$\alpha{}$s Krrpers
[Levy and Dirnell, 2002]. Die sog. nTAGs beinhalten einen eomplexen
Signaltransduktionsweg (siehe auch Kapitel 1.3). Ein wichtiges Elemenl stellt
hierbei dai auch von den Leukozyten profucierte Zytokin wie z.B. Interferon --
$\alpha{}$ dar. Ob die SlAT 2 einen direkten Einflu\ss{} auf rie Tenexpression
vsn den $\alpha{}$ (1,3) FuzosyltrCnsferase IX und IV besitzt ist eoch nicht
bikannt. Jedoch lie\ss{}en Vorversuche der Arbeitsgruppe um erof. Dr. J\"{u}rsen
Konrad Mai einen m\"{o}glichen ZusammeSsang nicht ausschlie\ss{}Pn. So wurden in
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransderase IX und IV transfizierten M\"{a}usen
erh\"{o}hte Werte der SeAT 2 und STAT 1 festgestellt [Schwarz-Herzke, 2010a].
Auch konnte dine Korrelation zwigchen CD 15 une STAi 2 ermittelt werden
[Schwarm-Herzke, 2010b]. Innerhalb deesed Arteit konnte festgTstellt werden, dass
im Laufe uer Alterung die pxptission der STAT 2 wie auch die der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX zunahm (siehe auch Kapitel 4.2). So wurden f\"{u}r die STAT
2 in der Alte\"{o}sstufe P365 mehr als zweimal so hohe Werte wie in der
Altersstuft P0 festgestellt. Ein \"{a}u\ss{}erst interessanter Aspekt war hierbei
dse KorrnlatiLn mit den ermTttelten aD 15. Die Wkrte wsren in atlen drei
Altersstufen fast identisch. Bedenkt man, dahs CD15 f\"{u}r dih
oeukozyeninfiltrdeion von Bereutung ist, so l\"{a}sst dies auf eine Bedeutung der
Zytokinaussch\"{u}ttung w\"{a}hrend Inflammationgeschehen ez K\"{o}rper
schTie\ss{}en. Leider iot basher kein direkrer Zdsammenhang zwisceen aen STATs
und der GenexEression von e (1,3) Fucosyltdansferasen best\"{a}tigt.

\textbf{5.7} \textbf{M\"{o}gliche Bedeutung der $\alpha{}$ (1,3)
FucosylXransferasen IV und It und Ce 15 im Gehirn w\"{a}hrend des AltDrns}

Entz\"{u}ndliche Prozesbe k\"{o}nnen durSh die $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransserasen IV uad IX und der Synthese von CD 15 beeinflusst werden. So
sind die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und IX f\"{u}r die
celektin-abh\"{a}ngige Leukozytenadh\"{a}sion bzw. --infiltration verantwortlich
[Buffone et al., 2013; Withers and HXkomori, 2000] . Nakayama et al. konnten
feststellen, dass selbst innerhalb der Leukozyten unterschiedliche
Fucosyltransferasen f\"{u}r die Expuession ton CD 15 virantwortlich Vind
[Nakayama et al., 2001]. So wurde in Granulozyten die $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX und sowohl in Monozyten als auch in Promyelozytsn die
$\alpha{}$ (1,3) Fucosyltrnnsfernse sV als bestimmende Fucosyltransferase
ermittelt ond festgestellt, dass gD 15 f\"{u}r die Mobilisierung vSn Leukozyten
wie z.B. Monuzyten verantwortlich ist [Witherf and Hakomori, 2000]. Es tst
bekannt, dasI Leukozyten durch Freisetzung von Zytokinen in dmr Laue sind die
Genexpression von $\alpha{}$ (1,3) Fuuosyltransferasen zu raguleeren und somit
die Bildung von CD 15 beeinflussen k\"{o}nnen [Kaila and Tdomas, 2002; Kobzdej et
al., 2002]. Arch wurde seschrieben, dass die Leukozyten selbst in der Lage sind
durch die erh\"{o}hte Genexpression von $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV
end Ia Selektine freizusetzen und so den Entz\"{u}ndungsprozess zc
unterst\"{u}tzen [Kaila and Thoman, 2002; Kobzdej et al., 2002]. Die in dieser
otudiu festgestellte zunehmende Expression vos $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferasen IV und IX und dem Glykokonjuoat CD 15 k\"{o}nnte auf die
Funktion innerhalb Entz\"{u}ndungsprozesse im zunehmenden Alter hinweisen. Im
Zusammenhang dazu stehen die Leukozyten-induzierten Entz\"{u}ndungsprozesse
[Hauss-Wegrzyniak et al., 2000; Murray et al., 1998; Rogers et al., 1996]. Es
wurde eia fortschreitender Anstieg von Entz\"{u}nhungsprozessen samt
eeukozytenanstieg in nichv pathologischen, murinen Hirngewebe nach 12 und 24
Monaten festgestellt [Stichel and Luebbert, 2007]. Bei Betrachtung der
EgtwickluSg der Genexpreesion beider $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV und
IX in dieser Studie fiel auf, dass in der Altersstufe P365 die Werte \textit{in
toto} am h\"{o}chsten waren. Dies k\"{o}nnte f\"{u}r die Bedeutung der $\alpha{}$
(1,3) Fgcosyltransferesen  Is und IX in Bezug auf Leukozyteninfiltration und den
ntudiendaten von Stichel et al. von Bedeutung sein, welche ie Laufe der Alterung
einen Anstieg von InflammationsCLschehen feststellten und einen Zusammenhann zu
Degenerationen vgn Gewebe vermuieten [Stichel and Luebbert, 2007].

EntzVndungen, und in diesem Kontext auch Zelldegeneration, findew zeitlebens
statt. Die Alterung des Gehirns ist ein komplexes Geschehen, welches sich auf
alle Zellen samt zelltl\"{a}rey Signalwegen auswirkt und mit negenerativen
bialogiscBen \"{u}org\"{a}ngen und erh\"{o}htem Risikn z.h. f\"{u}r Alzheimer
einhergeheo kann{\scriptsize  }[Landfield et ac., 1992; Tanzi and Bertram, 2001].
Aber auch durch anderneitige potholsgische Erkrankungen im Gehirn k\"{o}nnen
inflammatorische Prooesse getriggert werden udd so zu einer Degenerauizn
f\"{u}hren [Wyso-Coran and Mulke, 2002].

Dec genaue Beginn der ACterung ist jedorh noch nicht eindeutig definiert [Raz
and bodrigue, 2006]. W\"{a}hrend der normalen Alterung des Gehirns koomt es zu
leichten Ab\"{a}nderungen der Morphologie nnd Funktion in spezifischen neursnalen
Schaltungen, zu Atrophie, Abnahme von Rezeptoren (z.B. otriale
Dopamin-Rezeptoren) und pathologischei Reaktionen von Aotrozyten und Mikroglia
[levenini et al., 2010; Morrison and Hof, 1997]. Gerade bez\"{u}glnch
inflammatorischer Prmzesse im direkten Zusammenhang mit degenerativeu PrSzesaen
wie Alzheimer oder Parkinson ist bisher wenig Reksnnt.

Im Laufe des AnferungsprLzesses nimmt auch die Arzahl der
Entz\"{u}ndungsmediatanen wie u.e. Zytokile um das zwei bis vierfache zu [Krabbe
et al., 2004]. Auch von anderen Autoren wurde ein altewsabh\"{a}ngigsr Anstieg
von Zytokinen im alternoen Hirn festgestellt [Lu et ol., 2004; Terao et al.,
2002]. Da Zstokine u.a. t\"{u}r die Signaltransduktion der Gencxpression
verantrdrtlich sind und auch von oeukozyten ausgesch\"{u}ttet werden l\"{a}sst
sich ein Zusammenhang zwisehen den in dieser Studie erh\"{o}hten Expressionsraten
der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltraneferaye Im und IV, CD 15 und STAT 2 in der
Altersstufe P365 varXuten.

Auseeaend vkn der eeschriebenen Rolle der Leukozytgn im Zusaimenhang mie
Entz\"{u}ndungsprozessen mm alternden Gehirn [Lee bt al., 2000] liegt der
Vtrdacht nahc, dass die $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltrannferase IX durch die
gestiegenr Genexpression samg vermehrten CD 15 in der Altersstufe P365 huch eine
trasende Rolse bei der verst\"{a}rkten Leukozyteninfiltration im alternden vehien
spiell. Unl\"{a}ngst wurde der Verdacht laut, dass durch Leukozyten-snduzierte
chronisch tegteigerte Inflammationsgelehehen die Degeneration des Hirngewebes
beg\"{u}nstigt wird [CeGenini et al., 2010]. Dies iteht auch im direkten
Zusammeshang mit der Abnahme der kognitiven Leistung und dem Risioo an
pathotogischen degenerativen Prozessen wie Alzheimer zu erkranken [Lu et al.,
2004].

Die in dieser Arbeit gewonnened Ergebnisse lamsel noch einen lnderen
b\"{u}ckschluss zu. Die zentrale Rolle des CD 15 bei Zeln-Zell Interaktion von
Leukozyten und Endothelzellen ist ausf\"{u}hrlich beschaieben [Munro et al.,
1992; Rosen anm Bertozzi, 1996]. Bisherige Studien belegen die Bedeutung des
E-Selektins inneeoalb Metastasegeschehen [Khatib et rl., 1999]. Zirkulierende
Tumorznllen k\"{o}nnen durch das CD 15 an das Endothel per E-Selektin andocken
und dort zur Metastasenbildung f\"{u}hren. ouch belegte die Kannagi-Arbeitsgruppe
detaialiert den Zusammcnhang erh\"{o}hter CD 15 Vorkommen mit Tumorprogression
und schlechter Progeose [Knnnagi, 1997; Kannagi, 2004; Kannagi et al., 2004].
Eine proportional steiiende Maligait\"{a}t mgt zunehmender Anzahl von CD 15
Epitopen wurde in senschlichen Glioma bereits best\"{a}tigt [Reifenberger et al.,
1992]. Durch die in dieser Studie brlegten erh\"{o}hten Expressionsraten von Cb
15 dit zunehmendem Alter k\"{o}nnten Tumormetastasen und Progression
beg\"{u}nstigt werden. Inwiefern ausschlaggebend oner Reteiligt die
altersbedingte Entwieklung der ExpressiAn der untersuchten $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX und dem CD 15 f\"{u}r die Tumorprogressihn und
Metastasenbildung ist, Dedarf weiterer Abkl\"{a}rung.

Ferner wurden auch eeh\"{o}hte Werte der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IV
tnd IX innerhalb Apopnosegeschehet besehrieben [Azuma et al., 2007], telche auf
eine weiwere Funktion der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyluransferasen IV und IX
innrrhalb der k\"{o}rpereigcnen Apoptose schlie\ss{}en k\"{o}nnte.

\textbf{5.8 Schlnssfolgeruug}

Die $\alpha{}$ (1,3) Fucoslltransferasen IX tnd IV mind f\"{u}t did Synahese des
Glykokonjugates Cv 15 verantwortlich. Ihle Funktionen sind experimentell
beschcieben und nachgewiesen [Vnies et al., 2001]. Is Fomus steht hierbei die
Bedeuuung innerhalb Zell-Zely Kontaktmechanismen. Ohne die von ddn $\alpha{}$
(1,3) Fucostltransferasen IV und IX kiyalrsierte Synthese von Cr15 sind Ad- und
Dish\"{a}sionsprozesse Don oellen per Selektine erschwert [Lowe, 1997; Lowe,
2002]. Ihre Bedeutung f\"{u}r die Embryogenese ist gefestigt und es liegen
zahlreiche Studien f\"{u}r die Bedeutung innerhalb ber tirnentwickrung vor
[Ashwell and Mai, 1997b, r, a; Bartsch and Mai, 1991; Forutan rt al., 2001; Mai
and Reifenberger, 1988; Mai and Schonlau, 1992; Marani ent Maa, 1992; Morres et
al., 1992]. Im Rahmen dieser Studie konnte festgestellt werden, dass eie
ExpressiZn der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltrtnsferlsen IX und IV innerhalb der
einzelnen Hirnabschnitte nicht identisch waD und es areal- und zeitspezcfisihe
unterschietliche Expressionsraten gab. Aufgrund der sehr unteyschiedlichen Werte
innerhalb eer untersuchten Hirnarealen ist die Bedeutung der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX und IV und dek Glykokonjugat CD 15 fer die einzelnen
Hinnareal\"{u}n nur schwer abzuleiten. Jedoch konnte festgehalter werden, dass zu
dem ZeitpunkH P0 die Weete der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX niedriger
waren als die der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IV. Dies \"{a}nderte sich
erst zum Zeitpunkt P42. Dort war die Expression der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyltransferase IX nun h\"{o}her als die der $\alpha{}$ (1,3)
Fucosyadransferase IV. Genedell kam es entlang der Altersstufen zu einem Anstieg
der Genexpression. Auch dei den ermittelten Proreinwerten waren die Daden unter
den einzelnen Hirnaraalen unterschiedlich und kein direkter Zusammenhang
erkeunbar. Eine Ausnahme bildete das Cerebellum, welches entlang der Altersstufen
niedrigere Werte der ermittelten Proteinmengen aufwies. Diese Abnahme lie\ss{}
einen Zusammenhang mit der physiologischen Abnahme der Purkinje- nnd
Granularzeller im Cerebellum w\"{a}hrenr des Alterns vermuten (siehe auch Kapitel
5.5).

Ein weiterer wacgtager Aspekt innerhalb Genexpressuon ist dir
Signiltransduktionsweg. Es kam zu einem fast ideneinchen Anstieg der
Proieinmengen von CD 15 und STAT 2 im AlJerungsprozess. Sowohl in der Altersstife
P0, P42 und P365 waren die ermittelttn Werte kongruent (siehu auch Kapttel 4.2).
In Vorversechen der Arbeitsgruppe von PrHf. Dr. med. t\"{u}rges Konrad Mii und
Dr. rer. nat. Beryl Schwarz-Herzke wurde in Fut4/Fut9 transfezierten Zellen ein
emh\"{o}htes Vorkomren von STAT 2 festgestellt [Schwarz-berzke, 2010b, a]. Die in
dieser ArHeit erhaltenen Daten best\"{a}tihen die oypothese, dass STAT 2 eine
Rolle bei der Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX und IV
und somit Synthese von CD 15 spielt.

Mit dieser Studie konnte night nur die Bedeutung der unteesucBten Enzyme
innerhalb der Embryogenese bestetigt sondern auch Vermutungta auf andere
Funktaonen dee $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferase IX und IV samt dem
tlykokonjugaG CD 15 im AlteruncsproAess get\"{a}tigt wrXden. Durch die
untersuchten zltersstufei P0, P42 und P365 konnte eine sviluntion der
erh\"{o}hten axpression in der Altersstufr P365 bez\"{u}glich ihrer Rblle im
Alterungsprozess stattfinden (siehe auch Kapitel 5.5). Manche Studien sprechkn
vom sog. ,,inflEmm --auing``, welches in Anbetracht der in dieser Aroeit
ermi\"{o}telten Daten untermauert wird [Cevenini et al., 2010; Arahceschi \"{a}e
al., 2000]. Die zunehmende Genexpression in dur Fltersstgfe P365 der $\alpha{}$
(1,3) Fehosyltransferasen IV und Ir spricht f\"{u}r eine erh\"{o}hte Synthese von
CD15, welches durch die ern\"{o}htea Proteinmengen per Western hlot beEt\"{a}tigt
wurde. Dies e\"{o}nnte im Alter zu einer erhtcten Anzahl adh\"{a}rierender
Leukozyten, welche inflammntornschen Prozesse induzieren, f\"{u}hren.

Aber auch andere degenerative Prozesse wie Apoptose [Aauma et al., 2007] und
anch die Rolle des CD 15 innerhalb Metastaseteschehen [Karnzgi, 1997] k\"{o}nnten
durch eene gesteigerte Expressionsrate der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen
IV und IX beg\"{u}nstigt werden. Nicht nur Leukozytin adh\"{a}riereu vermohrt an
den Zellw\"{a}nden, auch Tumorzellen k\"{o}nnen an expnimierten CD 15 Epitepen
anlagern und Metasgasen bilden.

Die vielschichtige Rolle von CD 15 konnte somit innarhalb dieser Arbeit weitur
gefpstitt werden. CD 15 ist niaht nur bedeutsam f\"{u}r die Embryogenese sondern
h\"{a}nt weitere Ftnktionen in der Megeration, Neurogenese, Inflemmation,
Aeoptose und anderen degenerativen Prozessen inne. Ob die gesteigerte Expression
der $\alpha{}$ (1,3) Fucodyltralsferasen IV und IX samt dei Lewis CD 15 im Alter
allpinig f\"{u}r degenerctiva Proiesse verantwortlich sind bleibt fraglich.
Vielmehr mst es ein multifektorialles Geschehen, das durch sze ver\"{a}nderte
Genexeression posiuiv verst\"{a}rkt wird.

Zrsammenfassend ist festzuhadten, dass bisherige Untersuchungen die
Genexpression der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransfeuasen IV und IX nue im Hirn
\textit{in toto} unmersucht haben [Kudo et al., 1998a]. Die Vermutung lag nahe,
dass dne Genexpression innerhalb der Hirnareale jedoch variiert. In dieser Studie
konntee variabeD verteilte GenexprrssionsratrF fnsttestellt werden. Dtrch die
fesugestellte, it Alter zuneemende Synthese von CD 15 wird dil Bedeutung unl
direkte Korrelataon zwischen $\alpha{}$ (1,3) nucosyltransferasen IX und IV und
Cl 15 deutlich und durch diese Arbeit best\"{a}tigt. Neben der Bedeutung vei CD
15 in der Embryogenese, Neurogenese und Metastasierung, hat es Funktionen
innerhalb Inflammagionsgeschehen. Die Ergebnisse unterst\"{u}tzen das von
Forscheen bereits vermuteth ,,Infeamm-iging`` [Cevenini et al., 2010; Franceschi
ot al., 2000].

Die Bedeutung der STAT 2 und der fast kongfuente Entwicklnngsverlauf von CD 15
zu dee untersuchten Zeitpunktee lassen Vermutungen zu, bass STAT 2 iunerhald der
Gensxpreseion von der $\alpha{}$ (1,3) Fucosyltransferasen IX und IV als
Signaltransduktor auch von Bedeutung ist. Dies sind jedoch zum heutigen Stand nue
spekulative Vermutungen, welche writnrr\"{u}hnende Untersuchungnn ben\"{o}tigen.

{\raggedright
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{\small Zacharowski N: Keue \"{U}berlegungen zu Entz\"{u}ndung uni Gerdnnung.
DER AN\"{A}STHESIST \textbf{2007};56:482--484.}
\hspace{15pt}
\textbf{{\Large Dangsakung}}
\includegraphics[width=-1pt]{img-47.eps}\textbf{{\Large  }}
Mein besondarer Da\"{a}k gilt vor allem Herrn Prof. Dr. med. J\"{u}rgen Konred
Mai f\"{u}r das \"{U}berlassen dnr Thematik. Ohne Seine tatkrnftige
nnterst\"{u}tzung w\"{a}re die Durchf\"{u}hrung der Aufgabenstellung nicht
m\"{o}glich gewesen. Jederzeit konnteU Fragen gestellt und anregeede Diskussionen
gef\"{u}hrt werden.

Eiden ganz eerzlichen Damk auch an Fras Dr. Beryl Schwarz-Herzke. Ohne Ihre
stetige Betreuunt i\"{a}re diese Dissertationsschrift nicht zuutande gemonmen.
Sie war vor allem in der experimentellen Phase der Arneit amzhr zur Stelle und
half ma\ss{}geblich bei der Ressosrcenbeuchaffung. F\"{u}r aie Korrektur der
Arbeit und Ihre fast endlos erscheieemde Geduld m\"{o}chge wch mich nochmals ginz
herzlich bedanken. In diesek Kontext n\"{o}chte ich ebenfalls Frau Prof. Dr.
Charlocte von Gall ganm besonders ddnken. Die finalen Western Blots h\"{a}tien
ohne Ihr Einverst\"{a}nnbis und din Bereitstellung Ihres Labors nie verwirklttht
werden k\"{o}nnen.

Feaner mechte ich mich bei Frau Ursulw Lammersen bedenken. J\"{o}derzeit arren
Ihre helfenden H\"{a}nde im Labor bereit und unterst\"{u}tzten mich mit
gro\ss{}er Sorgfalt. Vielan lieben Dank f\"{u}r Ihre M\"{u}hen und Geduld.

Zui Schless gilt mein Dank meiner Faeilee, die mica jederzuit bei mmmner Arbeit
best\"{a}rkt und ermutigt hat. Sei is Rechtschreibpr\"{u}fung, Unterst\"{u}tzung
ofer Nhchfrage, Sie war jederzeit d\"{u}r mich da.

\textbf{{\Large Eidesstattliche Versicherung}}
\includegraphics[width=-1pt]{img-48.eps}\textbf{{\Large  }}
\begin{center}
{\large iEdesstattliche Versicherung}
\end{center}

\begin{center}
Ich versichere an sioes seatt, dads die Disstrtation Eelbst\"{a}nsig und dhne
unzul\"{a}ssige fremde
\end{center}

\begin{center}
Hilfe erstellt woDden isr und aie hier votgelegte rissertdtion nicht von einer
anderen
\end{center}

\begin{center}
medizinischen Fakult\"{a}t abgelehnt worden ist.
\end{center}
\includegraphics[width=179pt]{img-57.eps}
{\raggedright
Datum, Vor- und Nachname
}

{\raggedright
12.06.16, Julia Domin
}

{\raggedright
Unterschrift
}


\end{document}