Kapitel I

Einleitung

1. Die Bedeutung von Staphylokokken:

Erste Berichte über Staphylokokken lassen sich in das 17.Jahrhundert zurückverfolgen. In der damaligen Zeit konnte man noch nicht sicher zwischen pathogenen und harmlosen Staphylokokken-Isolaten differenzieren, dies gelingt erst im 20.Jahrhundert.

Erst da erkennt man den Zusammenhang zwischen der Plasmakoagulase-Aktvität bei Staphylokokken und ihrer pathogenen Bedeutung, so daß S. aureus als die pathogenere der beiden Staphylokokkenarten erkannt wird.

Zwar wird heutzutage die Plasmakoagulase-Aktivität auch zur Differenzierung zwischen Staphylococcus aureus (S. aureus) und anderen Staphylokokken-Isolaten eingesetzt, jedoch hat es nicht mehr den hohen Stellenwert, da noch andere Kriterien von Bedeutung sind.

Staphylokokken werden zur Familie der Micrococcacae gezählt, die man wiederum in vier Untergruppen einteilen kann: Planococcus, Stomatococcus, Micrococcus und Staphylococcus.

Die drei letztgenannten kann man bei Mensch und Tier nachweisen.

Staphylokokken-Spezies werden weiterhin in Koagulase-positive und Koagulase-negative Vertreter eingeteilt, wobei diese Einteilung keine Aussage über Verwandschaftsgrad oder ihre Pathogenität zuläßt.

Von den Koagulase-positiven Staphylokokken ist der S. aureus der wichtigste humanpathogene Vertreter, bei den Koagulase-negativen ist es Staphylococcus epidermidis [46].

Staphylokokken gehören als harmlose Bewohner zur Normalflora der menschlichen Haut und Schleimhaut, wobei einige von ihnen sich auch zu einer gesundheitlichen Bedrohung entwickeln können.

Infekte können sich dabei auf endogenem oder exogenem Weg entwickeln.

S. aureus kann grundsätzlich alle Körperstellen besiedeln, es wird dabei aber der Nasen-Rachenraum und das Perineum als Hauptstandort favorisiert [59].

Die klinisch zunehmende ernsthafte Bedeutung ist in den Bereichen Resistenzentwicklung, sowie in der Entwicklung von nosokomialen Infekten zu sehen.

2. Die Kulturen von Staphylococcus aureus:

Bei S. aureus handelt es sich um runde bis ovale, grampositive, sich in Haufen oder Trauben anordnende Kokken, mit einem Durchmesser von ca. 0,8-1µm.

Aufgrund ihrer Pigmentierung sind die Kolonien von gold-gelben Colorit.

Der Keim ist ein fakultativer Anaerobier, der sich leicht auf gewöhnlichen Nährmedien, am optimalsten bei 37° C, kultivieren läßt.

S. aureus ist vergleichsweise resistent gegen eine Reihe von physikalischen und chemischen Einflüssen [34].

2.1. Der Feinaufbau von S. aureus:

Die Zellwand von S. aureus besteht aus einer typischen, grampositiven Mureinschicht, mit der lineare Teichonsäuren und Polysaccharide kovalent verknüpft sind. Zusätzlich sind in der Zellwand Lipoteichonsäuren befestigt, die sich in der Mureinschicht fortsetzen und darüberhinaus nach außen ragen.

Nahezu alle S. aureus Stämme weisen ein auf ihrer Oberfläche gebundenes Enzym, den sogenannten „clumping-factor“ auf. Dieser ist das zellgebundene Pendant zu der extrazellulären Koagulase und in der Lage Fibrinogen zu binden und es in Fibrin umzuwandeln [34,54].

Bei den meisten Stämmen wird die Mureinschicht vom sogenannten Protein A überlagert, mit dem es kovalent gebunden ist [78].

Weiterhin sind die meisten S. aureus-Stämme in der Lage Kapselpolysaccharide zu produzieren [17,69].

Das zellwandgebundene Protein A interagiert mit dem Fc-Anteil von Immunglobulin G der meisten Spezies.

Dieses Protein wirkt anti-opsonierend und es können sich nun Phagozyten mit ihrem Fc-Rezeptor nur erschwert an die unspezifisch mit Antikörpern dicht besetzten Bakterien anheften, die wiederum dadurch erschwert bekämpft werden können [57,67].

Die für das Protein A kodierende Gen-Sequenz (spa) findet man benachbart zu der mec-Determinanten und diese besteht aus 2,150 bp und beinhaltet eine Anzahl von funktionell unterschiedlichen Regionen: eine Fc-bindende Region, die sogenannte X-Region und die C-terminalen Region, die eine Rolle bei der Anheftung an die Zellwand spielt [18,19,58,89].

Sequenzierungen des spa-Gens zeigen, daß die Fc-bindende Region aus bis zu fünf 160-bp langen Wiederholungen bestehen kann, diese werden als die Domänen E, D, A, B und C, abhängig von ihrem N-Terminus bezeichnet [67,78].

Die anschließende X-Region umfasst ein Oktapeptid(Glu-Asp-Gly-Asn-Lys-Pro-Gly-Lys), das bis zwölfmal wiederholt wird(Xr) und eine sogenannte nicht repetitive Sequenz(Xc), die ein C-terminales, hydrophobes Ende enthält.

Die X-Region stellt sich hochgradig polymorph dar und das führt zu der Erkenntnis, daß es Unterschiede in der Anzahl der Sequenzen und der Sequenz selbst innerhalb der einzelnen Stämme geben muß. Diese Tatsache kann man sich für molekulare Untersuchungen von Bakterienstämmen zu Nutze machen [18,19,67].

In einigen Fällen konnte ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der gefundenen repetitiven Sequenzen und dem epidemischen Charakter des eingesetzten Stammes hergestellt werden: Stämme, die mehr als sieben repetitive Sequenzen aufwiesen waren als epidemisch wirksam einzustufen, während Stämme, die lediglich sieben oder weniger repetitive Sequenzen zeigten als nicht-epidemisch zu bezeichnen waren [18].

Es müssen also noch andere Genabschnitte bei der epidemischen „Wirkung“ eine Rolle spielen [18,90].

Molekulare und genetische Untersuchungen zeigten außerdem, daß die Ausprägung des Protein A zusätzlich noch von verschiedenen Wachstumsbedingungen und von der einzelnen Stammzugehörigkeit abhängig ist [67].

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protein A mit seinen einzelnen Abschnitten [57]

Kapselpolysaccharide sind bei mehr als 90% der S. aureus-Isolate nachweisbar, wobei elf verschiedene Kapsel-Typen(CP1-CP11) unterschieden werden können, von denen wiederum in 80% die Typen CP5 und CP8 vorherrschen. Ihre Auswirkung auf die Virulenzausbildung bleibt dabei jedoch noch unklar.

Einige Autoren konnten einen Zusammenhang zwischen den vorliegenden Kapselstrukturen CP5 und CP8 und einer verminderten Ansprechrate auf Phagozytose aufzeigen .

Spätere Studien konnten diese Vermutungen nicht bestätigen, denn die CP5 und CP8-Stämme waren nicht virulenter einzustufen als die Stämme, die keine Kapselstrukturen besaßen [17,69].

2.2. Die Pathogenitätsfaktoren von S. aureus:

S. aureus ist in der Lage, zahlreiche extrazelluläre Substanzen sowie Zellwandproteine zu synthetisieren, die zum Teil zu klinisch manifesten Infekten führen können [12,13].

Die Virulenz eines Stammes wird dabei durch die Summe dieser biologischen Aktivitäten und nicht nur durch eine einzelne extrazelluläre Substanz bestimmt.

-Koagulase: wandelt Fibrinogen in Fibrin um

-Alphatoxin( Alphahämolysin): dieses Toxin hat eine membranschädigende Wirkung, im ZNS letale sowie lokal dermo-nekrotische Wirkung

-Leukocidin: bewirkt eine Degranulierung von Phagozyten und Makrophagen

-Exfoliativtoxine: zwei Exfoliatine können eine Dermatitis exfoliativa auslösen, wobei ca. 5% der Stämme dieses Enzym produzieren können

-Staphylokinase: spaltet Fibrin durch Konversion von Plasminogen in Plasmin

-Nuklease: spaltet DNA und RNA

-beta-, gamma-und delta-Hämolysine

-Enterotoxine: es existieren fünf verschiedene Serotypen (A-E, Gruppe C nochmals in C1-3 unterteilt), die für Lebensmittelintoxikationen verantwortlich gemacht werden, die Toxine B und C können zusätzlich zu einem Toxic-Shock-Syndrom führen

-Toxischer-Schock-Syndrom-Toxin 1(TSST-1): dieses Toxin wird von ca. 90% der Stämme produziert (wobei es aber nur in 5-25%der Fälle am Toxic Shock Syndrom beteiligt ist).

Es stimuliert Makrophagen zur Ausschüttung von bestimmten Mediatorsubstanzen [34].

3. Das Koagulase (coa)-Gen:

Die Koagulase von S. aureus ist ein extrazelluläres Protein, das sich spezifisch mit humanem Prothrombin binden kann. Dadurch wird eine Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin ausgelöst.

Fibrinogen steht als Faktor I vor dem Endprodukt Fibrin am Schluß der Gerinnungskaskade des intrinsischen und extrinsischen Blutgerinnungssystems [27].

Die Koagulaseproduktion wird in Laboratorien gerne zur Differenzierung pathogener S. aureus gegenüber anderen Staphylokokken-Isolaten eingesetzt [77].

Die Koagulase kann in acht verschiedenen Serovarietäten vorkommen, wobei die Produktion von bis zu vier immunologisch unterschiedlichen Formen dieses Enzyms durch ein und dasselbe S. aureus-Isolat möglich ist.

Diese wiederum werden von acht verschiedenen Allelen des Koagulasegens(coa) kodiert [22].

Das Gen hat eine Gesamtgröße von ca. zwei Kilobasen.

DNA-Sequenzanalysen des klonierten Koagulase-Gens von mehreren S. aureus-Isolaten wiesen drei wesentliche Abschnitte innerhalb des Gens nach:

1.) ein N-terminalen Ende, das die Prothrombin-Bindungs-Stelle enthält,

2.) eine zentrale Region, die hoch-konserviert ist,

sowie 3.) ein C-terminales Ende. Dort findet man vier bis acht repetitive Sequenzen, die jeweils 81 Basenpaaren umfassen.

Eine repetitive Sequenz kodiert dabei für 27 Aminosäuren, jedoch kennt man ihre genaue Funktion und den Grund für bestehende Divergenzen innerhalb der Sequenz noch nicht [22].

Es ist bekannt, daß die repetitiven Sequenzen weder für die Prothrombin-Bindung noch für die Plasmagerinnung von Nöten sind [77].

4. Pathogenese und durch S. aureus verursachte Krankheitsbilder:

Es können drei verschiedene Infektformen vorkommen, die als invasive Form, Toxikose und als Mischform eingeteilt werden.

1)Invasive Infekte:

Klinisch manifeste Infekte können durch S. aureus entstehen, wenn z.B. ein Hautdefekt als Eintrittspforte dient. S. aureus ist mittels der produzierten Enzyme Koagulase und Hyaloronidase in der Lage in tiefere Hautschichten einzudringen, also in vertikaler Richtung,entlang von Follikeln, Schweißdrüsen, unter Ausbildung von tiefen Abszeßhöhlen. (Im Gegensatz dazu breiten sich Streptokokken eher horizontal in oberflächlicheren Hautschichten aus). Das Bakterium kann die Submukosa und Subserosa durchdringen und führt dabei häufig zu einem lokal begrenzten Infekt, z.B. Erysipel [33].

Ein Infekt kann aber auch generalisiert verlaufen, z.B. als Impetigo contagiosa, v.a. auf pädiatrischen Stationen. Dabei überwiegt meist S. aureus als alleiniger Erreger, es kann aber auch zu Mischinfekten, wie z.B. mit A-Streptokokken kommen.

Als weitere Infekte gelten die hämatogene oder posttraumatische Ostitis/Osteomyelitis, die ulzeröse Endokarditis nach Herzklappenersatz, die Pneumonie bei länger beatmungspflichtigen Patienten; Septikämie bei Immungeschwächten oder Immunsupprimierten Patienten.

Auch länger liegende Fremdkörper, wie Venenverweilkanülen oder Dauerkatheter prädisponieren für Infekte [87].

2)Toxisch bedingte Infekte:

Die Bildung von Enterotoxinen kann zu Lebensmittelintoxikationen führen. 3-5 Stunden nach Verzehr von mit Toxin-kontaminierten Speisen beginnt die Erkrankung mit Übelkeit, Erbrechen und Diarrhoe [27].

3)Mischformen, wie z.B.Dermatitis exfoliativa neonatorum Ritter von Rittershain; es handelt sich hierbei um eine schwer verlaufende, lebensbedrohliche , durch Staphylokokken-Exfoliativtoxine ausgelöste blasige Ablösung der Haut. Diese Erkrankung tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf, seltener auch bei Immunsupprimierten. Ätiologisch findet man eine akantholytische Spalt-und Blasenbildung, ausgelöst durch das Exfoliativtoxin, ein Exotoxin der

Phagengruppe II.

Man beobachtet dabei das Phänomen der verbrannten Haut, wobei die Schleimhäute ausgespart bleiben. Die angegriffene Haut bietet nun zusätzlich auch den idealen Nährboden für weitere Besiedlung der Hautherde durch die Bakterien selbst. Diese sogenannten sekundären Infekte sollten deshalb neben der Staphylokokkenwirksamen Antibiotikaabdeckung auch lokal saniert werden [33].

5. Methicillin-resistente S. aureus (MRSA):

5.1. Definition:

Methicillin-resistente S. aureus-Stämme werden MRSA (Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus) genannt.

(Für Resistenztestungen wird im Labor das Antibiotikum Oxacillin eingesetzt, weil es sich durch seine bessere Stabilität eher für die Diagnostikeinsatz eignet als Methicillin. Trotzdem wird international weiterhin am Terminus MRSA festgehalten).

Die Resistenz bezieht sich dabei auf alle ß-Lactam-Antibiotika, einschließlich der Penicillinase-festen-Penicilline wie Oxacillin, Methicillin und alle Cephalosporine, auch ß-Lactamase-Inhibitoren sind hier oft schon wirkungslos.

Vielfach können auch keine Antibiotika anderer Wirkgruppen, wie z.B. Aminoglykoside mehr eingesetzt werden, da auch dort bereits Resistenzentwicklungen vorliegen(Multiresistenz) [50,70,74].

Die MRSA-Stämme können noch weiter unterteilt werden in Stämme mit hohem epidemischen Potential, die sogenannten „epidemischen“ MRSA(EMRSA) und die lediglich „sporadisch“ auftretenden MRSA(SMRSA) [95].

5.2. Epidemiologie:

Die Einführung des Antibiotikums Penicillin G in den 40er Jahren zur Bekämpfung von bakteriellen Infekten stellte eine Revolution dar, denn so konnte man die vorher lebensbedrohlichen Erkrankungen erfolgreich therapieren und so die Mortalität und Morbidität innerhalb der Bevölkerung senken.

Anfang der 50er Jahre fiel nun auf, daß vermehrt Staphylokokken-Stämme auftauchten, die gegen Penicillin resistent waren.

Man therapierte daher alternativ mit anderen Antibiotika, wie Tetracyclinen und Makroliden. Nach anfänglichen Erfolgen bildeten sich auch hier sehr bald Resistenzen.

1959 wurde das halbsynthetische Penicillinase-feste ß-Laktam-Antibiotikum Methicillin eingeführt, worauf es binnen kurzer Zeit wiederum zu Resistenzentwicklungen bei S. aureus-Stämmen kam, wobei die ersten Fälle in Großbritannien bekannt wurden [83].

Innerhalb der letzten Jahre breiteten sich diese Resistenzen weltweit zunehmend aus und werden zu einer immer größeren Bedrohung [96].

5.3. Therapie von MRSA-Infekten und dabei auftretende Schwierigkeiten:

Infekte mit MRSA sollten systemisch mit Antibiotika therapiert werden, hierbei treten häufig Schwierigkeiten auf, da die Isolate oft einerseits gegen alle ß-Laktam-Antibiotika, wie Penicilline,Cephalosporine, Carbapeneme, Monobactame, andererseits aber auch schon gegen viele Nicht-ß-Laktam-Antibiotika, wie z.B. Aminoglykoside, Gyrasehemmer, resistent sind [2].

Das 1956 eingeführte Glykopeptid-Antibiotikum Vancomycin und das 1984 eingeführte Glykopeptid-Antibiotikum Teicoplanin sind häufig Mittel der Wahl bei MRSA-Infekten. Sie werden vorwiegend i.v. und i.m. verabreicht, wobei sie eigentlich als Reserveantibiotika aufgrund ihrer neuro-und-nephrotoxischen Nebenwirkungen, sowie ihrer hohen Behandlungskosten fungieren [35].

Wenn möglich sollte vor Therapiebeginn ein Antibiogramm des Keims aufgestellt werden.

In den neunziger Jahren häuften sich Berichte, daß vermehrt MRSA-Stämme mit erniedrigter Ansprechbarkeit für die Glykopeptid-Reserveantibiotika (MHK-Wert 8µg/ml) in Japan und den Vereinigten Staaten isoliert werden konnten [1,28,79,80]. Die Ausprägung dieser Resistenz ist heterogen, ist assoziiert mit einer dickeren Bakterienzellwand und einer erhöhten Anzahl an Zellwand-Vorläufermolekülen. Auffällig ist dabei, daß diese Stämme eine größere Zahl an Penizillinbindungsproteinen(PBPs), sowie eine verbesserte Ansprechbarkeit für Methicillin aufzeigen [1].

Aufgrund dieser Resistenzentwicklungen wird die Forderung deutlich, daß einerseits wieder neue wirksame Antibiotika kreiert, andererseits aber auch verbesserte Therapieabläufe mit bestmöglicher Dosis-Wirkbeziehung aufgestellt werden müssen. Ebenso sollte sich gegenseitig optimal ergänzende Antibiotikagruppen eingesetzt werden [1,35].

Bereits 1988 wurde von ersten Infekten mit hoch-resistenten Enterokokken (Vancomycin-resistant enterococci [VCE] )berichtet.

1992 konnte eine Arbeitsgruppe unter Noble et al nachweisen, daß es zu einem Gentransfer zwischen Enterokokken und Staphylokokken unter Laborbedingungen kommen kann [56].

Dabei wird das vanA-Operon übertragen, jedoch konnten bisher keine klinischen Staphylokokken-Isolate, die eines der verantwortlichen Gene vanA, vanB, vanC oder vanD tragen, detektiert werden [85].

Es handelt sich also bei der Form der Glykopeptid-Resistenz wie er bei Staphylpkokken vorkommt nicht um den Mechanismus der bei den Enterokokken zum Zuge kommt.

Ein andere Arbeitsgruppe [79] stellte Vergleiche auf, indem sie die aktuell vorliegenden Keime mit Ur-Keimen aus der Zeit vor Antibiotika-Einsatz gegenüberstellte.

Daraus resultierte, daß für Teicoplanin heterogene Stämme und Stämme mit verminderter Ansprechbarkeit für diese Antibiotika intrinsisch vorliegen bei den Spezies, wogegen die Urstämme jedoch noch homogen sensibel waren [79].

Auf der anderen Seite können Bakterienstämme unter Laborbedingungen selektiv Vancomycin-Resistenzen mit erniedrigten MHK-Werten erlangen, dieser Vorgang ist reversibel [79].

Unter Zugabe von Vancomycin zum Kulturmedium während der Wachstumsphase, bildeten die Bakterien große Zellaggregate und produzierten eine große Menge an extrazellulärem, zellwandähnlichem Material [79].

Weiterhin wurde Zellwand-Peptidoglykan mit einer veränderten Muropeptid-Zusammensetzung produziert und das Vancomycin wurde in biologisch aktiver Form aus dem Kulturmedium entfernt.

Die Leichtigkeit mit der die Keime unter Laborbedingungen zunehmende MHK entwickeln läßt nur die Frage zu, warum nicht KNS mit höheren Glykopeptid-Resistenzen in der Menge der bislang isolierten worden sind [79].

5.4. Ursachen der Penicillin-Resistenz:

Penicillin und andere ß-Lactamantibiotika sind als Chemotherapeutika in der Lage, Bakterien abzutöten, indem sie eine Transpeptidase inaktivieren, die die endgültige Vernetzungsreaktion bei der Peptidoglykan-Synthese katalysiert.

Die Vernetzungsreaktion ist wichtig, da sie die Bakterienzellwand festigt und ihr dadurch Stabilität verleiht.

ß-Lactam-Antibiotika ahmen den D-Ala-D-Ala -Rest des Mureinvorläufermoleküls nach und können auf diese Weise eine kovalente Bindung mit einem Serin-Rest im aktiven Zentrum des Penicillinbindungsproteins (PBP) eingehen.

Durch die Bildung des nun irreversiblen Penicillin-Enzym-Komplexes wird seine Enzym-Eigenschaft gehemmt und auf diese Weise wird die für die Bakterien so wichtige Vernetzungsreaktion sabottiert [24,81].

Für die Methicillin-Resistenz können drei verschiedene Mechanismen verantwortlich gemacht:

1.) Produktion an ß-Lactamasen und

2.) ein zusätzliches Penicillin-bindendes-Protein(PBP)

3.) ß-Lactamasen und PBP-unabhängige Resistenz

ß-Lactamasen, auch Penicillinasen genannt, sind in der Lage enzymatisch den Laktam-Ring von ß-Lactam-Antibiotika zu zerstören und sie somit unwirksam werden zu lassen.

Dieser Form der Resistenzentwicklung konnte mit der Einführung von Penicillinase-festen-Penicillinen (z.B. Methicillin) begegnet werden.

Der zweite Resistenzmechanismus beruht auf der Fähigkeit, ein zusätzliches, neues Penicillin-bindendes-Protein bilden zu können, das sogenannte PBP2a. Diese Resistenz betrifft nun auch Penicillinase-feste Penicilline.

Der dritte Resistenzmechanismus kann durch verschiedene Mechanismen bedingt sein. Diese Resistenzform ist PBP2a-unabhängig, kann durch eine Überproduktion an ß-Lactamasen bedingt sein, kann aber auch durch eine modifizierte Form von PBPs( MOD-SA= „modified“ S. aureus, [86]) oder aber auch durch eine neu beschriebene Methicillinase bedingt sein [20].

5.5. Die Regulation der ß-Lactamasenproduktion:

Das ß-Lactamase-Gen (blaZ) ist Teil eines Plasmids und wird hauptsächlich durch zwei benachbarte Abschnitte, blaI und blaR1, die chromosomaler Herkunft sind, reguliert.

Die Rolle der Genprodukte von blaI und blaR1 sind zwar noch nicht ergründet, aber durch Studien mit Bacillus licheniformis konnte man Rückschlüße auf die regulatorische Funktion von blaI und blaR1 ziehen:

Wenn blaR1 nun von einem ß-Lactamantibiotika gebunden worden ist, wird ein Signal für die blaZ-Transkription durch die Zellmembran direkt in die Zelle ausgesandt. Durch welchen Mechanismus nun das Repressorprotein dazu bewegt wird von der Operator-Seite abzudriften, um nun die blaZ-Transkription zuzulassen ist nicht bekannt, aber es scheint, daß ein zusätzliches chromosomales Element, das blaR2, dabei unterstützend wirkt [25].

5.6. Die Rolle der PBP:

Das PBP selbst stellt ein membrangebundenes Enzym dar, das an der Zellwandsynthese als Transpeptidase, Endopeptidase oder Carboxypeptidase teilnimmt. Diese Eigenschaften konnten bislang jedoch noch nicht eindeutig erklärt werden.

Die PBP sind in der Lage, das Vorläufermolekül Disaccharid-Pentapeptid zum Zellwandpeptidoglykan zu polymerisieren.

Dies führt zu einer Störung und somit Hemmung des Wachstums und einem durch Autolyse bedingten Zelltod der Bakterien.

Methicillin-sensible S. aureus-Stämme können über 5 verschiedene PBPs (1, 2, 3, 3´ und 4) verfügen, die als essentiell bezeichnet werden.

Die spezifischen Funktionen der einzelnen PBPs sind nur teilweise bekannt, wobei die PBP 1-3 als wichtig angesehen werden für das Wachstum und das Überleben der Bakterien.

MRSA verfügen über ein zusätzliches 78-kilodalton PBP( PBP2a oder PBP2`), das bei sensiblen Stämmen nicht nachzuweisen ist.

Ebenso besitzen Methicillin-resistente, Koagulase-negative-Stämme ein zusätzliches PBP, es handelt sich bei dem zusätzlichen PBP2a/PBP2`jedoch keineswegs um ein mutiertes PBP [3,24,41,42,47,64].

Der Vorteil des zusätzlichen PBP2a liegt darin, daß es über eine deutlich niedrigere Affinität gegenüber ß-Laktam-Antibiotika verfügt, als die anderen, essentiellen PBPs [81,82,91].

Normale PBPs binden Antibiotika bereits bei niedrigen Konzentrationen, während bei PBP2a sehr hohe ß-Laktam-Antibiotika-Wirkspiegel nötig sind. Wenn nun mit Antibiotika therapiert wird, ist der normale essentielle Satz zwar „ausgeschaltet“, aber das verbliebene PBP2a ist nicht beeinträchtigt und kann nun alleine die Zellwandsynthesefunktion der übrigen PBPs übernehmen [24,65].

Dadurch können Bakterien ungestört von den ß-Laktamantibiotika ihre Zellwand aufbauen und die Folge ist die Resistenz gegenüber allen ß-Laktam-Antibiotika.

Diese Form der Resistenz benutzen wir den Begriff der „intrinsischen Resistenz“, um sie von der ß-Laktamasen-abhängigen Resistenz abzugrenzen [82].

5.7. Intrinsische Resistenz:

Die intrinsische Resistenz kann in drei unterschiedlichen Phänotypen erscheinen: als sogennnte „heterogene“ , als „homogene“ Resistenz-Form und eine neu beschriebene, die sogenannte „eagle-type“-Resistenz.

Stämme mit homogener Resistenz exprimieren eine einheitliche Resistenz, die im gesamten Stamm gleichermaßen ausgeprägt ist.

Bei den heterogenen Stämme dagegen ist der größte Teil, ca. 99.9% der Bakterien empfindlich für ß-Lactam-Antibiotika, während der Rest hochresistente Gruppen bildet [41,42].

Heterogene Stämme können durch unterschiedliche Minimale-Hemmkonzentrationen (MHK) auffallen, was auch ein Charakteristikum von MRSA ist.

Eine neue Form der Resistenz wurde als „eagle-type“ Form beschrieben [37].

Bei dieser Form wird eine Resistenz gegenüber hohen Methicillin-Konzentrationen ( um 64-512µg/ml)beobachtet, während die Isolate bei niedrigen Methicillin-Konzentrationen sensibel reagieren(um 2-16µg/ml).

6. Das mecA-Gen:

6.1. Die Rolle des mecA-Gens

Das Protein PBP2a wird durch das mecA-Gen kodiert, das dadurch eine zentrale Stellung bei der Ausbildung der Methicillin-Resistenz einnimmt.

Bei dem mecA-Gen handelt es sich um ein 2,130-bp langes Segment, das einen Teil eines Transposons darstellt [39,80,91].

MecA und seine Promoterregion sind innerhalb der Koagulase-positiven und Koagulase-negativen Methicillin-resistenten Staphylokokken hochkonserviert, dagegen findet man in sensiblen Staphylokokken kein Allel-Äquivalent [3,4,5,24,62,63,65,81].

Man ist sich noch nicht völlig sicher, woher das mecA-Gen stammt.

Einige Autoren glauben, daß sich das mecA-Gen vielleicht über Millionen von Jahren in Erd-Bakterien entwickelt hat, die damals selbst in der Lage waren ß-Lactam-Antibiotika zu produzieren. Diese Resistenzen dienten entweder als Schutz vor Antibiotika aus anderen Bakterien oder aber als Schutz vor den eigenen Antibiotika [81].

Einige andere Autoren unterstützen die These, daß das Gen bei allen Methicillin-resistenten Staphylokokken-Spezies von einem einzelnen Vorläufer-Klon abstammen muß und das es von einem vertikalen Gen-Transfer herrührt [38].

Andere Autoren, wie Masur und Kappur, sowie Archer, propagieren, daß es nicht von einem einzelnen Klon abstammt, sondern daß es von einem horizontalen Gentransfer herrühren muß [3].

Wahrscheinlich wird die gesamte mec-Regulator-Region zusammen, mit den mec-Genen aktiv von einer Staphylokokken-Spezies auf eine andere übertragen [62,81,82] und es ist auf jeden Fall sicher, daß das mec-Gen die Voraussetzung für die Ausprägung der Resistenz ist.

Spätere Untersuchungen ergaben, daß die Orginal-mec-Determinante von Koagulase-negativen Staphylokokken abstammen könnte und dann auf S. aureus übertragen wurde [83].

Einen möglichen Beweis für diese These ergaben Untersuchungen von Archer (1996), der bei einigen S. aureus-Isolaten eine für Staphylococcus-haemolyticus-spezifische Insertionssequenz (IS1271) an der mec-Region isolierte. Weitere Untersucher isolierten eine mecA-homologe Sequenz bei Staphylococcus sciuri, die zu 80% Genhomologien mit PBP2a aufwies [16].

Abbildung 2: Schematische Darstellung der mecA-Determinante und seiner benachbarten Region bei MRSA

5` zu mecA findet man das Transposon Tn554 im Genom integriert. Dieser enthält die Erbinformation für Resistenzen gegen Erythromycin, Spectinomycin und Cadmium. Zwischen Tn554 und der mecA-Region befinden sich die Gene für die Regulatorproteine mecR1 und mecI oder Deletionen dieser Sequenzen [28,38,83].

3` zu der mecA-Region findet man den sogenannten dru-Abschnitt (direct repeat unit), der aus mehreren repetitiven Sequenzen besteht.

Diesem Abschnitt folgt der Teil eines offenen Leserasters orf145, daran schließt sich die Insertionssequenz IS431(auch IS257 genannt)an. Es wird angenommen, daß diese Insertionsstelle eine Rolle spielt beim Gen-Transfer. Diese Region stammt wahrscheinlich von einem verschiebbaren Element ab und ist unter Staphylokokken weitverbreitet [4,55].

Der Bereich zwischen mecA und IS431 wird auch hypervariable Region bezeichnet, da sich dieser Teil innerhalb der verschiedenen MRSA-Stämme je nach Verwandschaftsgrad stark voneinander unterscheiden kann [55,62].

Nach dem IS431-Teil können ganze Abschnitte ins Genom integriert sein, ev. sogar zwischen weiteren Kopien des IS431, das wahrscheinlich als Insertionsstelle für weitere Resistenzdeterminanten dient [16,65].

6.2. Die Regulation des mecA-Gens:

Die mecI und mecR1-Gene kodieren für Regulatorproteine, wobei das mecI-Gen für ein Repressorprotein kodiert, während das mecR1-Gen für ein Membranprotein kodiert.

Das Membranprotein agiert dann als Signalüberträger, um die mecI-Gen dirigierte Hemmung des mecA-Gens zu veranlassen [29].

Wenn ß-Lactamantibiotika vorhanden sind, wird die Repression aufgehoben und das mecA-Gen ist aktiviert [3,82].

MRSA mit intakt vorliegender mecI /mecR1-Region, zusammen mit mecA heißen pre-MRSA, der Prototyp ist der S. aureus-Stamm N315.

Während das intakte mecI-Produkt zu einer starken Unterdrückung der PBP2a-Expression führt, ist das pre-MRSA Methicillin-sensibel und die Methicillin-Resistenz auch durch Antibiotikazugabe ins Kulturmedium nicht induzierbar [29].

Bei 40% der MRSA findet man im mecI-Gen Deletionen oder Punktmutationen [38,82].

Folglich müßte eine Entfernung dieses Kontrollgens zu einer Methicillin-Resistenz führen, sofern das mec-Gen vorhanden ist.

Verwunderlich ist, daß der erste isolierte MRSA-Stamm aus England aus dem Jahr 1961 kein mec1-Gen in seinem Genom aufweisen konnte, obwohl er den mecR1-Anteil besaß.

Eine Arbeitsgruppe unter Hurliman-Dalei folgerte daraus, daß die alten MRSA-Stämme zwar das mecA-Gen innehatten, die mec-Regulatorgene jedoch später erwarben.

Eine andere Arbeitsgruppe untersuchte ebenfalls den N315-Stamm und kam zu dem Schluß, daß dieser zunächst das mecI-Gen besaß, es dann jedoch durch eine Deletion verloren haben muß.

Das führt zu der Annahme, daß die genetische Veränderung bei der Mehrheit der MRSA in zwei Schritten ablaufen muß: Zunächst muß ein mecA-Gen erworben werden, zusammen mit seinen Regulator-Genen.

Der zweite Schritt führt nun entweder zu einem Verlust durch Deletion oder aber Inaktivierung des mecI-Gens durch Mutation [82].

Ein andere Autor geht noch einen Schritt weiter und sagt, daß es einen weiteren Schritt in der Resistenzausbildung geben muß.

Die hetero-resistenten Stämme bilden Subklone, aus denen sich homogen-resistente Subklone entwickeln können, wobei zwei Gene, hmrA (high-methicillin-resistent) und hmrB, dafür verantwortlich sein sollen.

Obwohl die genaue Funktion, sowie der Mechanismus noch unklar ist, steht fest, daß eine Überprodukion dieser zu einer „Umschaltung“ der Stämme von heterogen in homogen führen muß [29].

Auffällig ist auch, daß die Regulatorregion und die ersten 300 Basepaare des Gens homolog zu dem ß-Laktamase-Gen sind.

Es könnte eine Erklärung dafür sein, auf welche Weise sich das PBP2a entwickelt haben könnte, nämlich durch eine Fusion zwischen den ß-Lactamase-Genen und einem PBP, das jedoch nicht von Staphylokokken abstammt [49].

Die identische Basenanordnung läßt weiterhin die Schlußfolgerung zu, daß die Regulation der PBP2a-Produktion und der ß-Laktamasen identisch sein muß. Dabei spielen die Gene, die für die Regulation der ß-Laktamasen-Produktion zuständig sind eine Rolle [23-26].

Studien zeigten, daß in erster Linie die Gene blaI und blaR1 sowohl das blaZ-Gen als auch das mecA-Gen kontrollieren, auch wenn die Regulatorgene mecR1 und mecI anwesend sind.

Der Grund ist wahrscheinlich darin zu suchen, daß ein Repressor des ß-Laktmase-Produktion gleichzeitig auch an den Operator des mecA-Gens bindet und dadurch dessen Transkription unterbindet [25].

Es gibt jedoch Faktoren, die die heterogene Resistenz beeinflußen, diese sind in der nachfolgenden Tabelle ersichtlich (Der genaue Mechanismus ist hierbei jedoch noch nicht bekannt).

Wenn diese Faktoren nicht berücksichtigt werden beim Nachweis der MRSA könnte es passieren, daß heterogene Stämme irrtümlich als Methicillin-sensibel deklariert werden, da nur ein geringer Anteil der Zellen resistent ist.

Daraus können sich falsche Therapieansätze ergeben [52].

7. Faktoren, die das Resistenzverhalten von S. aureus ändern können:

-Osmolarität

-Inkubationstemperatur

-Inkubationszeit

-Inokulummenge

-pH-Wert

-Passagen mit ß-Laktam-Antibiotika-Zusatz

Die meisten S. aureus-Stämme produzieren induzierbare ß-Laktamasen, wobei der ins Medium freigesetzte Anteil vom Stamm und zusätzlich von den Kulturbedingungen abhängt.

Endemische Isolate in Kliniken produzieren eine große Mengen an ß-Lactamasen, von denen ca. 40-60% ins Medium entlassen werden.

Eine Arbeitsgruppe unter Kim und Chipley konnte nachweisen, daß der Zusatz von NaCl zum Kulturmedium die Bedingungen für die Produktion der ß-Lactamasen verbessert.

In Anwesenheit von 5-10% NaCl in der Wachstumsphase war die Konzentration an produzierten ß-Lactamasen im Medium höher als bei Kulturen ohne diesen Zusatz.

Daraus schlossen sie, daß die S. aureus-Isoltate auch bei hohen Salzkonzentrationen überleben können, weiterhin nicht zerstört werden trotz hoher Ausschleusung von ß-Lactamasen und daß hohe Salzkonzentrationen zudem noch die Lactamasen-Produktion und Abgabe fördern [48].

Eine andere Arbeitsgruppe unter McDougal fügte dem Medium lediglich 2% NaCl hinzu, denn aufgrund ihrer Erfahrungen konnte man so am besten zwischen Methicillin-resistenten und heteroresistenten Stämmen unterscheiden, ohne Verfälschungen mit nicht-heteroresistenten Stämmen zu erzielen [48,50].

Ein weiterer Parameter um das Resistenzverhalten zu variieren wäre die Inkubationstemperatur, die zwischen 30°C bis 35°C liegen sollte [41].

Es wird vorgeschlagen auch die Inkubationszeit von 24 Stunden auf 48 Stunden zu verlängern, denn man hat festgestellt, daß resistentere Stämme längere Anwachs-Zeiten benötigen als sensible.

Weiterhin sollte man eine höhere Inokulummenge wählen, denn hierdurch werde die Wahrscheinlichkeit erhöht, einen resistenten Stamm zu entdecken.

Ebenso hat man festgestellt, daß der pH-Wert nicht unter 5,1 liegen sollte, da dadurch eventuelle Resistenzausbildungen gehemmt werden können [23,43].

Die Kulturen sollten auch längeren Antibiotika-Passagen unterworfen werden, denn so kann man die Selektion von resistenten Stämmen fördern [10,43].

Das National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS) hat einen Grenzwert für Resistenz festgelegt: Diese Minimale-Hemm-Konzentration (MHK) liegt dabei für Oxacillin bei >2 µg/ ml [20]. Dieser Wert gibt die Antibiotikakonzentration an, bei dem kein sichtbares Bakterienwachstum im Nährmedium mehr vorhanden ist, die MHK-Werte werden mittels des Mikrodilutionsverfahrens ermittelt.

8. Borderline-Resistenz:

Weiterhin wird in der Literatur der Begriff der „borderline“-resistenten (BORSA) oder der „low-level“-resistenten MRSA benutzt [10,47,49,81].

Die MHK-Testungen für Oxacillin liegen bei diesen Isolaten zwischen 1,0 bis 8,0 µg/ ml angesiedelt, das laut Definition zwischen der Einstufung „empfindlich„und „resistent“ liegen kann, und deshalb als grenzwertig bezeichnet wird [20].

Diese Stämme unterliegen einem anderen, PBP2a-unabhängigen Resistenzmechanismus:

Sie zeigen stattdessen eine erniedrigte Empfindlichkeit gegen alle ß-Lactam-Antibiotika, da sie in der Lage sind große Mengen an ß-Lactamasen zu produzieren.

Die ß-Lactamasen hydrolysieren sehr schnell Penizillin und viele Penicillinase-feste-Penizilline.

Eine Arbeitsgruppe unter McDougal testete die Stabilität der einzelnen Antibiotika in Anwesenheit von ß-Lactamasen, wobei eine abnehmende Stabilität in folgender Reihenfolge festgestellt werden konnte:

Methicillin> Cephalotin> Oxacillin> Penicillin.

MRSA-Stämme können erfolgreich mit irreversiblen ß-Lactamase-Hemmern, wie Clavulansäure und Sulbactam therapiert werden, wobei diese nicht das Bakterienwachstum selbst hemmen können.

Aus diesem Grund sollten sie in Kombination mit anderen ß-Lactam-Antibiotika eingesetzt werden, um ergänzend wirken zu können [48].

Die Unterscheidung, ob der vorliegende Stamm nun eine intrinsische Resistenz oder eine grenzwertige Resistenz besitzt ist sehr wichtig, da die Keime unterschiedliche therapeutische Maßnahmen verlangen und der Zeitfaktor oftmals für den Verlauf einer Infektion entscheidend ist.

Stämme mit intrinsischer, high-level-Resistenz sollten mit Vancomycin therapiert werden, während die low-level-resistenten Stämme, die kein mecA-Gen oder PBP2a innehaben, mit ß-Lactam-Antibiotika behandelt werden.

Infekte mit low-level-resistenten Stämmen erfordern auch nicht die teuren und umständlichen Maßnahmen, die sich aus den bei Infektion mit high-level-resistenten Stämmen nötigen Isolationsmaßnahmen ergeben [20].

9. Die Rolle der fem-Faktoren bei der Regelung der Resistenzausprägung:

fem bedeutet übersetzt: Faktoren für die Expression der Methicillin-Resistenz.

Durch welche Mechanismen oder Gene nun die unterschiedlichen Resistenz-Ebenen eingeschaltet werden, z.B. low-level in eine höhere Resistenzstufe, ist bisher nicht bekannt.

Der Grad der Resistenz bei Methicillin-resistenten S. aureus wird zwar durch die PBP2a-Expression beeinflußt, korreliert aber nicht mit der Menge an produzierten PBP2a und den vorliegenden Antibiotikakonzentrationen [8].

Daraus kann gefolgert werden, daß zusätzliche Gene vorhanden sein müssen, die essentiell sind für die Regelung der high-level Resistenzausprägung verantwortlich sind [41,44,52].

Diese chromosomalen Faktoren werden fem-Gene oder aux-Gene genannt.

Es existieren vier verschiedene Typen, femA-D und sie liegen außerhalb der mec-Determinante auf chromosomaler Ebene und werden für die Peptidoglykan-Synthese benötigt [8,92].

Man findet sie sowohl bei MRSA, als auch bei MSSA, jedoch nicht in anderen Staphylokokken-Spezies [8,44,66,91].

Die Regionen femA und femB sind in einem Operon zu finden.

Wen nun Mutationauftreten im femA- oder femB-Gen auftreten, werden verkürzte Substrate produziert.

Diese Vorläfersubstrate sind suboptimal und deshalb kommt es zwar zu einer noch normalen Quervernetzung des Substrats, aber der Vernetzungsgrad ist geringer als bei „normalen“ Peptidoglykanvorläufermolekülen.

Für das PBP2a ist das suboptimale Substrat nutzlos, denn es kann es nicht verwerten.

Das wiederum bedeutet, daß die Keime PBP2a zwar korrekt exprimieren, aber dennoch sensibel gegenüber Chemotherapeutika sind.

Die Folge ist eine abgeschwächte Ausprägung der Methicillin-Resistenz, wobei der Einfluß des femB dabei schwächer ausfällt.

Mutationen im femC- und femD-Gen führen lediglich zu einer Abschwächung der basalen Resistenz bei heterogenen MRSA, während der Einfluß auf die hoch-resistenten Subpopulationen sehr gering ausfällt.

Diese Ergebnisse treffen sowohl auf die homogenen als auch auf die heterogenen Stämme zu [8].

Völlig unbeeinflußt bleibt dabei die Produktion der PBP2a, wenn die fem-Faktoren ausgeschaltet werden [8].

10. Nosokomiale Infekte:

Zu nosokomialen Infekten zählt man Infekte, die während eines Aufenthalts im Krankenhaus erworben werden und als Komplikation des Grundleidens welcher Art auch immer resultieren [35,61].

Die häufigsten nosokomialen Infekte sind Pneumonien, Septikämien und Wundinfekte, wobei Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) neben E.coli und Pseudomonas aeruginosa zu den Haupterregern gezählt werden [71].

In Europa werden alarmierend hohe Infektionsraten mit zunehmenden Antibiotikaresistenzen beobachtet, wobei ein Nord-Süd-Gefälle zu verzeichnen ist:

In den Skandinavischen Ländern liegt die Anzahl der Methicillin-resistenten Isolate unter einem % und bei über 30% in Frankreich und Italien. In Spanien stieg die Zahl dramatisch an von 1,5 % im Jahr 1986 auf 17,9 % in 1996, teilweise aber auch auf bereits 44 % in einigen Krankenhäusern [51].

In Deutschland lag die durchschnittliche Inzidenz von MRSA 1994 bei weniger als 5 % bezogen auf die Gesamtzahl isolierter S. aureus-Stämme involviert in Krankenhausinfekten [94].

Ein bestimmtes Patientengut ist besonders gefährdet für nosokomiale Infekte: Es handelt sich dabei vor allem um Patienten, die auf Verbrennungsstationen, Intensivstationen und chirurgischen Stationen nach invasiven Eingriffen liegen.

Ebenso sind Patienten mit länger belassenen Fremdkörpern, wie arteriellen bzw. venösen Dauerkathetern und Patienten mit einer erhöhten Anfälligkeit für Infekte, z.B. Diabetiker, betroffen [59,87].

Obwohl nicht nachgewiesen werden konnte, daß MRSA-Stämme virulenter als andere Stämme sind, sind sie dennoch verantwortlich für eine immens hohe Mortalitätsrate bei infizierten Patienten, wobei der Grund höchstwahrscheinlich in der Resistenzentwicklung gegenüber vielen Antibiotika zu sehen ist [62,95].

Die erhebliche Zunahme dieser Erreger in Kliniken in den letzten Jahren hängt zum einem mit dem erhöhten Einsatz von Kunststoffmaterialien und intravasalen Fremdkörpern während Therapie und Diagnostik zusammen, auf der anderen Seite kommt es durch den vermehrten Einsatz von Breitspektrumantibiotika bei Prophylaxe und Therapie zu einem Selektionsvorteil für die Erreger [87].

Bei einem stark pflegebedürftigen Patienten liegt das Risiko sich mit einem MRSA-Keim zu infizieren bei ca.84% und einem länger als 7 Tage dauernden Krankenhausaufenthalt erhöht sich das Risiko auf bereits 95% [68].

Diese Infekte erschweren die Behandlung von Patienten und können sich bei einigen Patienten sogar zu einer Lebensbedrohung entwickeln [100].

Zusätzlich kann es durch den Transfer von Patienten in verschiedene Krankenhäuser zur überregionalen Ausbreitung von nosokomialen Infekten kommen.

Außerhalb von Kliniken werden diese Infekte äußerst selten erworben, sind dann häufig bei Drogenabhängigen zu finden [45].

Der intensive Antibiotika-Einsatz in Kliniken erhöht das Risiko der Resistenzentwicklung, da ein eindeutiger Selektionsvorteil für resistentere Keime produziert wird [50,72].

Die Maßnahmen zur Bekämpfung und Verhütung von nosokomialen Infekten entsprechen in etwa den allgemeinen Methoden zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten, wobei diese in drei Gruppen eingeteilt werden :

• betriebliche Maßnahmen

Hierbei handelt es sich um desinfizierende Maßnahmen bei der Pflege und Therapie der Patienten, sowie bei der Reinigung von OP-Räumen, Behandlungsräumen sowie der einzelnen Stationen.

Die Desinfektion muß mit geeigneten Desinfektionsmitteln unter Beachtung der richtigen Konzentration und ausreichender Einwirkzeit durchgeführt werden.

Besonderes Augenmerk ist dabei auf die Desinfektion der Hände beim medizinischen Personal zu legen, da insbesondere kontaminierte Hände eine potentielle Streuquelle für die Patienten darstellen. Außerdem sollten auch regelmäßige prophylaktische Nasenabstriche zur Kontrolle im Krankenhaus beim Pflegepersonal durchgeführt werden [21,34,59].

Bei eventuellem Befall sollte eine adäquate und ausreichend lange Sanierung der Herde erfolgen. Man hat dabei auch beobachtet, daß bei Keimen, die unter Laborbedingungen sensibel für bestimmte Medikamente waren, häufig in vivo keine therapeutisch ausreichenden Wirkstoff-Spiegel für diese Medikamente erreicht werden konnten.

Für die adäquate Sanierung des HNO-Bereichs wurden spezielle antibiotische Darreichungs-Formen, wie z.B die Antibiotische Nasensalbe Mupirocin(=Pseudomoninsäure A )entwickelt. Es besteht jedoch immer die Gefahr von möglichen Resistenzentwicklungen und von Rezidiven [87].

Bei Kolonisation mit MRSA stehen Hygiene und Dekontaminations-Maßnahmen im Vordergrund.

Manchmal müssen Patienten strikt isoliert werden, um eine weitere Verbreitung zu unterbinden.

Bei oropharyngealer Besiedlung sollte das Personal bei Maßnahmen mit Aerosolbildung, wie es beim Absaugen von Patienten entsteht, einen Mundschutz tragen, denn auf diese Weise kann S. aureus ebenfalls übertragen werden.

Bei Besiedlung der Haut kann durch tägliche Waschungen mit Chlorhexidin-haltiger Seife, alternativ mit Octenidindihydrochlorid, dezimiert werden [87].

• Organisation:

Die Organisation der Krankenhaushygiene muß sich nach dem jeweiligen Strukturmodell des Krankenhauses richten.

Optimal wäre hierbei die Einrichtung und Etablierung einer sogenannten Hygienekommission, wobei der ärztliche Direktor des Krankenhauses die Aufgabe des Vorsitzenden übernehmen sollte.

Die Aufgabe der Kommission wäre die Analyse der Situation und die Festlegung der erforderlichen Maßnahmen zur Verbesserung der Hygiene, Organisation des Funktionsablaufs, Unterrichtung des Personals in Krankenhaushygiene-Fragen und eine fortwährende Reflektion.

• bauliche Maßnahmen:

Bei Neubauten und bei der Sanierung von Altbauten hat der planende Architekt die Pflicht sich von Hygienefachleuten bei der Planung und Ausarbeitung der Pläne mitberaten zu lassen.

11. Unterscheidung Infektion und Kolonisation:

Beim Nachweis von S. aureus-Isolaten ist es wichtig, zwischen einer Infektion und einer Kolonisation zu unterscheiden: Eine Kolonisation geht einer Infektion voraus.

Außerdem gibt es „gesunde“ Keimträger, ohne körperliche Beeinträchtigungen, die unbewußt eine Streuquelle darstellen können, und Personen, die infiziert sind [71].

12. Vorkommen und unterschiedliche Keimträger:

Abhängig vom Untersuchungskollektiv sind 10-90% der “gesunden“ Normalbevölkerung Keimträger, während dieser Wert beim Krankenhauspersonal noch höher angesiedelt ist [34].

Man unterscheidet weiterhin zwischen persistierenden, intermittierenden und sporadischen Keimträgern.

Der persistierende Keimträger trägt den gleichen Staphylokken-Stamm über einen gewissen Zeitraum auf seiner Haut/Schleimhaut [71].

Davon abzugrenzen ist der intermittierende Träger, der auch ständig von einem Staphylokokken-Stamm „besiedelt“ ist, bei dem aber mehrere verschiedene Stämme nachweisbar sind.

Wogegen der sporadische Typ nur vorübergehend von Staphylokokken besiedelt ist [71].

Infekte mit MRSA können auf endogenem oder exogenem Weg ablaufen.

Wenn der Patient selbst eine Infektionsquelle darstellt handelt es sich um eine endogene Infektion und wenn ein Keim von einer Person auf eine andere übertragen wird (z.B. durch Klinikpersonal) spricht man von einer exogenen Infektion.

Im Krankenhaus sind beim Klinikpersonal als Hauptreservoir die Hände mit einem Anteil von ca. 56% und das Vestibulum nasi mit ca. 62% anzusehen, wobei die Übertragung direkt sein kann durch z.B. Händeschütteln oder indirekt über berührte Gegenstände [86].

Die mittlere Halbwertszeit für die Keime liegt bei ca. 40 Monaten, es sind aber auch Fälle bekannt , bei denen der Keim für mehrere Jahre nachweisbar war [84].

Manchmal können auch mehrere MRSA-Stämme gleichzeitig nachweisbar sein während eines KrankenhausInfektausbruchs [19].

13. Polymerase-Kettenreaktion (PCR):

Die Polymerase-Ketten-Reaktion( PCR = polymerase chain reaction) ist eine Methode, die eine selektive, enzymatische in vitro-Amplifikation einer spezifischen DNA-Region ermöglicht.

Erste Beschreibungen dieser Methode findet man im Jahr 1985 [66].

Dabei wird eine in vivo-DNA(Desoxyribonukleinsäure)-Replikation nachgeahmt.

wobei Genabschnitte, die amplifiziert werden sollen von zwei bereits bekannten Nachbarsequenzen eingerahmt werden.

Als Startsignal benötigt man einen sogenannten Primer, es handelt sich dabei um kurze, einsträngige DNA-Moleküle, die sich jeweils komplementär zu den

letzten Nukleotiden einer definierten Gensequenz der DNA-Matrize, dem sogenannten template verhalten.

Der zu amplifizierende DNA-Strang muß vorher denaturiert werden und liegt dann als Einzelstrang vor.

Unter Hinzufügen einer DNA-Polymerase und in Anwesenheit von Desoxyribonucleosidtriphosphaten wird der eingesetzte Primer entlang der DNA-Matrize verlängert und es werden neue DNA-Stränge synthetisiert, die dann als Doppelstränge vorliegen und komplementär zur eingesetzten DNA-Matrize sind.

Um die DNA-Stränge erneut zu vervielfältigen, müssen diese erneut mittels Hitze aufgespalten werden, damit sie wieder als Einfach-Strang vorliegen und nach kurzer Abkühlung kann dieser wieder mit den eingesetzten Primern reagieren, das wird durch eine verschachtelte Aneinanderreihung von Zyklen mit definierten Phasen erreicht.

Im Verlauf dieser aneinandergereihten Zyklen kann jeder neu synthetisierte DNA-Strang wiederum auch als Matrize dienen, dabei ist dann eine exponentiell ansteigende Vervielfältigungsrate zu verzeichnen.

Prinzipiell handelt es sich bei der PCR um ein einfach durchzuführendes Verfahren, wobei bestimmte Optimalbedingungen die Durchführung erleichtern.

Voraussetzung für eine optimale Amplifizierung ist die Auswahl von geeigneten Primern.

Die Primer müssen so ausgesucht werden, daß sie anti-parallel zueinander in der Lage sind an beide Stränge der DNA zu hybridisieren, auf diese Weise kann die ausgesuchte Sequenz amplifiziert werden.

Die optimale Primerlänge liegt bei 18 bis 30 Basen.

Ebenso ist die Basensequenz von Bedeutung, wobei der ideale G/C-Gehalt im allgemeinen zwischen 45 und 55% angestrebt werden sollte.

Außerdem sollte der Primer möglichst komplementär zu der gewünschten DNA-Sequenz sein und sogenannte G/C-clamps ausbilden, das sind mehrere aufeinanderfolgende G/C oder C/G-Basenpaare zwischen dem 3`-Ende des Primers und der Template-DNA.

Weiterhin sollte auf Komplementaritäten innerhalb eines Primers durch Palindrome oder lange Sequenzen von Polypuriunen und Polypyridinen sowie komplementären Bereichen zur Sequenz des zweiten Primers verzichtet werden, denn dadurch wird die Ausbildung von sogenannten Primer-Dimeren gefördert, die störend wirken können.

Die eingesetzten Primer sollten ähnliche Schmelztemperaturen (Annealing-Temperaturen) aufweisen.

Diese kann anhand der WALLACE-REGEL [70] ermittelt werden:

[2• (A/T)+ 4 •(G/C)] = Annealingtempertur in °C

Diese Regel gilt für Primer, die um ca. 20 Nukleotide lang sind, für längere müssen umfangreichere Formeln eingesetzt werden.

Ideale Schmelztemperaturen liegen meist um 55 bis 65°C, wobei die in der Praxis eingestellte Temperatur oftmals höher anzusiedeln ist als die errechnete.

Dewegen werden zur Optimierung der Ergebnisse weitere PCR-Protokolle mit jeweils um 2 bis 5° C höheren Annealingtemperaturen durchgeführt.

Es ist auch darauf zu achten, daß die Annealingtemperaturen nicht zu lang sind.

Die Hybridisierung der Primer erfolgt sehr schnell, denn dieser Vorgang ist bereits innerhalb weniger Minuten beendet und daher sind Annealingzeiten von 10 bis 20 Sekunden ausreichend.

Lange Annealingzeiten sind deswegen auch zu vermeiden, weil sie keineswegs zu einer besseren Ausbeute führen, sondern zur vermehrten Bildung von unspezifischen PCR-Produkten.

Die Verlängerung der Primer erfolgt in Anwesenheit von Desoxynukleotiden und einer thermostabilen DNA-Polymerase.

Die PCR verläuft in einer bestimmten Abfolge, die aus verschiedenen Zyklen mit unterschiedlichen Phasen zusammengesetzt ist.

Anschließend erfolgt eine Inkubation bei 72°C für 5 Minuten, die sogenannte „Final-Extension“.

Nach Ablauf aller PCR-Phasen werden die PCR-Produkte auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.

Zur Bestimmung der Größen der entstandenen Fragmente wählt man einen Größenstandard als jeweils erste und letzte Bande.

Durch den Zusatz von Ethidiumbromid zum Agarosegel bei der Herstellung können die Produkte nach elektrophoretischer Trennung mittels UV-Transluminator sichtbar gemacht und fotografisch festgehalten werden.

14. Staphylokokken als Toxinbildner

14.1 Enterotoxine und TSST-1:

Die Zelloberflächen-Strukturen von Ag-präsentierenden Zellen nennt man HLA-Antigene. Diese werden vom sogenannten MHC(major histocompatibility complex)-Gen-Komplex auf dem Chromosom 6 kodiert und in zwei Hauptgruppen unterteilt: die MHC-Klasse-I-Antigene HLA-A,-B und-C, die auf fast allen kernhaltigen Zellen vorkommen und die MHC-Klasse-II-Antigene HLA-D (-DQ,-DP und -DR), die vorwiegend auf Immunzellen exprimiert werden [34].

T-Lymphozyten erkennen keine freien, sondern nur an solche Zellen gebunden Antigene.

Die von S. aureus produzierten Enterotoxine A-E,G-I und das TSST-1 können als sogenannte „Superantigene“ wirken. Andere Superantigene sind Exfoliativtoxine von S. aureus, Exotoxine(SPEA und SPEC) von Streptococcus pyogenes, sowie das M-Protein von Streptokokken [49,53,78,99].

Die „Superantige“ sind eine Gruppe von bakteriellen oder viralen Eiweißen, die zwei Bindungsstellen besitzen: eine für den variablen Teil des Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und eine für sogenannte MHC-Klasse II Moleküle.

Die Superantigene können T-Zellen unspezifisch aktivieren und dadurch werden Zytokine frei, die als Mediatorsubstanzen dienen und zu einer schockartigen Symptomatik führen können [33,99].

Die Toxine werden hauptsächlich in der postexponentiellen Wachstumsphase gebildet, dabei können sie sowohl jeweils einzeln vorkommen als auch in bestimmten Kombinationen [33].

14.2. Durch Enterotoxine ausgelöste Lebensmittelintoxikationen:

Die meisten S. aureus-Stämme produzieren eines oder mehrere Exotoxine aus der Familie der pyrogenischen Exotoxine, worunter auch die Staphylokokken-Enterotoxine, sowie das sogenannte Toxischer-Schock-Syndrom-Toxin (TSST-1) fallen. Die Enterotoxine sind die Verursacher von weltweit vorkommenden Lebensmittelvergiftungen bei Menschen und anderen Primaten-Spezies.

Die Toxine werden in verdorbenen Nahrungsmitteln innerhalb weniger Stunden gebildet, sind sehr hitzestabil und werden teilweise auch durch 30-minütiges Erhitzen auf 100°C nicht zerstört.

Diese Intoxikation stellt eine häufige Erkrankung mit hoher Dunkelziffer dar, meist sind mehrere Personen betroffen, die eine gemeinsame Mahlzeit innerhalb der letzten 1-16 Stunden eingenommen haben.

Nach einer kurzen Inkubationszeit von wenigen Stunden beginnt die Erkrankung mit Übelkeit, Erbrechen, Diarrhoe und ev. abdominellen Krämpfen.

In schweren Fällen oder bei geschwächten Personen, sowie Kindern kann es zu extremen Elektrolyt- und Flüssigkeitsverlusten kommen, die zur orthostatischer Kreislaufdysregulation, Kollaps und schlimmstenfalls zum Exitus führen können [27,75].

14.3. Genetischer Hintergrund der Enterotoxine und TSST-1:

S. aureus ist in der Lage fünf verschiedene Enterotoxine zu bilden, die Toxine A-E, wobei das Toxin C in drei Untergruppen CE 1-3 unterteilt werden kann und weiterhin das TSST-1.

Obwohl die Enterotoxine und das TSST-1 ähnliche Effekte auf das Immunsystem ausüben, führen das TSST-1 und die Enterotoxine zu unterschiedlichen Krankheitsbildern [53,75].

Die Enterotoxine zeigen einen ähnliche Grundstruktur, die aus einer Polypeptid-Kette (26-29 kDa) besteht, mit einer einzelnen Disulfid-Schlinge. Das TSST-1 ist im Gegensatz dazu ein kleineres Protein (22 kDa) ohne Disulfid-Schlinge.

Die Aminosäure-Sequenzen für die einzelnen Toxine, sowie ihrer korrespondierenden Gene sind bereits sequenziert und veröffentlicht worden [31, 54].

Die drei entC-Gene zeigen einen hohen Grad an Übereinstimmungen in der Basensequenz, die bei ca. 98% untereinander liegt und eine teilweise Übereinstimmung mit dem entB-Gen von ca. 74 %.

Die Übereinstimmung von entB und entC zu entA liegt bei ca. 50% und ist damit niedriger eingestuft als von entA zu entE mit ca. 84%.

entD ist identischer mit entA und entE mit ca. 54%, als zu entB und entC mit 40%.

Dagegen zeigt das tst-Gen nur wenig Übereinstimmungen mit den ent-Genen [50].

Es ist auch offensichtlich, daß bestimmte Exotoxine bevorzugt autreten. Man findet z.B. die Kombinationen des Enterotoxins C1 mit dem TSST-1, sowie das Enterotoxin A zusammen mit dem TSST-1 bei menstruellen TSS-Infekten (in 71% der Fälle) im Gegensatz zu nicht-menstruellen TSS ( in 24% der Fälle) oder bei nicht-TSS-Isolaten ( in 12% der Fälle). Das Toxin C1 und das Toxin B werden nur selten durch S. aureus „ko-produziert“ und die Kombination von TSST-1 und des Enterotoxins B findet man noch seltener [9,30].

Einige Autoren fanden heraus, daß Stämme die Gene sowohl für das Toxin B und das TSST-1 besaßen, trotzdem kein Toxin B produzierten, obwohl die Gene sehr nah beieinander liegen. Der Grund hierfür ist wahrscheinlich darin zu sehen, daß das tst wahrscheinlich in einer „günstigeren“ Insertionsstelle liegt [9,30].

Das TSST-1-Gen(tst) wurde ursprünglich in E.coli durch Kreiswirth(1983) kloniert. Es ist chromosomal lokalisiert und besteht aus 702bp und kodiert für ein Protein, dessen Signalpeptid 40 Aminosäuren enthält. Die kodierende Sequenz des reifen Proteins weist eine Größe von 194 AS und eine Molekulargewicht von 22,049 kDa auf.

Computergestützte Analysen der Aminosäuresequenz des TSST-1 zeigten, daß es nur wenig oder keine strukturellen Ähnlichkeiten mit den biologisch verwandten Toxinen, wie den Streptokokken-Exotoxinen A-C oder den Staphylokokken-Enterotoxinen, aufwies [7].

Die Menge an produziertem TSST-1 ist abhängig von bestimmten Wachstumsbedingungen, wie Temperatur, Sauerstoff, Glukose und Antibiotikagehalt des Mediums.

Bei gleichbleibenden Bakterienwachstum wurde mehr TSST-1 bei 37°C als bei 30°C produziert.

Bei 40°C war die Bakterienwachstumsrate zwar niedriger als bei 37°C, aber die TSST-1-Produktion war erhöht [98].

Weiterhin wurde das Bakterienwachstum, sowie die Toxinproduktion bei einem Glukosegehalt von 3% im Medium unterdrückt.

Durch den Zusatz von Clindamycin, bei Konzentrationen die das Bakterienwachstum unbeeinflußt lassen, blieb die TSST-1-Produktion unterdrückt [39].

Weiterhin wirken sich aerobe Bedingungen stimulierend auf die TSST-1-Bildung aus, während anaerobe die Bildung komplett unterdrücken können, wobei zu hohe O2-Menge die TSST-1-Bildung auch verringern können.

Auch der Zusatz von CO2 kann sich positiv auf die Toxin-Produktionsrate auswirken. Die optimalen Konzentrationen der eingesetzten Gase liegen bei ca. 20 cm² / min für O2 und bei ca. 5 cm² / min für CO2.

Für die Enterotoxin B-Produktion wurden andere optimale O2-Zugaben gefunden. Die Toxin B-Produktion ist maximal bei der O2-Rate von 125-150 cm² / min [92].

Die Anwesenheit von Blutprodukten und Proteinen ist scheinbar auch ein begünstigender Faktor für die TSST-1-Produktion [14].

Der Beginn der Toxinproduktion ist nach der exponentiellen Wachstumsphase zu legen und die maximale Produktionsrate findet man vor der stationären Phase [97].

Das Enterotoxin A-Gen(entA), das chromosomal und Phagen-assoziert sein kann, besteht aus 771 bp, die für ein Vorläuferprotein von 257 AS kodieren. Das reife Protein besteht aus 233 AS und weist ein Molekulargewicht von 27,1kDa auf.

Das Enterotoxin B-Gen(entB) wurde 1985 in E.coli kloniert. Es ist nur chromosomal lokalisiert und Sequenzierungen zeigten, daß es aus 798 bp besteht, wobei 27 Aminosäuren für eine Signalsequenz kodieren.

Das reife Protein weist eine Größe von 239 AS und ein Molekulargewicht von 28,336 kDa auf [31].

Das Enterotoxin C-Gen(entc), kann durch drei Untergruppen repräsentiert sein,(CE1, CE2 und CE3) ist nur chromosomal lokalisiert.

Es wurde ebenfalls kloniert und sequenziert. Jedes der drei Gene kodiert für ein Protein der Länge von 266 AS, von denen die ersten 27 Aminosäuren für ein Signalpeptid kodieren.

Die reifen Proteine weisen dann ein Molekulargewicht von 27,56 kDa auf.

Die reifen ToxinC1-und C2-Proteine weichen in sieben Aminosäuren voneinander in der Sequenz ab, die allesamt im amino-terminalen Anteil lokalisiert sind.

Das reife C3-Protein weicht in vielen Aminosäuresequenzen im aminoterminalen Bereich von den anderen beiden ab.

Das C3-Signalpeptid zeigt zwar auf der einen Seite Abweichungen von den anderen beiden, auf der anderen Seite ist es aber identisch mit dem des Enterotoxin B-Gens [31,39].

Das Enterotoxin D-Gen(entD) liegt in einem Plasmid vor und Sequenzierungen zeigten, daß es einen ORF mit 774 bp besitzt, das für ein 258 AS langes Protein-Vorläufermolekül kodiert, das wiederum eine 30 AS langes Signalpeptid enthält.

Das reife Protein besitzt die Länge von 228 AS und weist ein Molekulargewicht von 26,36 kDa auf, außerdem zeigt es einen hohen Grad an Übereinstimmung mit anderen Staphylokokken-Enterotoxinen [5].

Das Enterotoxin E(entE) ist nicht Phagenassoziiert, obwohl das entA-und das entE-Gen sich am meisten ähneln. Hybridisierungsansätze werfen die Vermutung auf, daß das entE-Gen sich mit einem defekten entA-ähnlichem Gen eines Bakteriophagen verschmolzen sein muß [5,30].

Das Gen besteht aus 771 bp, das für ein 257 AS langes Vorläufermolekül kodiert. Das reife Protein weist ein Molekulargewicht von 26,425 kDa auf [10,39].

Es fällt auch auf, daß das entA-und das entB-Gen eine ähnliche biologische Aktivität zeigen und einen gewissen Grad an genetischer Ähnlichkeit aufweisen. Trotzdem ist das entA-Gen chromosomalen Ursprungs, während das entB-Gen Plasmid-assoziiert ist [30].

14.4. Toxischer-Schock-Syndrom:

Das seit ca. 1978 bekannte Toxischer-Schock-Syndrom (TSS) ist eine Multiorganerkrankung mit den obligaten Leitsymptomen Fieber, Hypotonie und Exanthem während der Akut-Phase und Desquamation in der Rekonvaleszenz-Phase.

Es wird verursacht durch S. aureus, gehäuft Phagengruppe I, Phagentyp 29/52, welches das sogenannte Toxischer-Schock-Syndrom-Toxin 1(TSST-1) produziert, wobei der Mechanismus noch nicht vollkommen aufgeklärt worden ist [33].

In den USA wurde TSS gehäuft bei jungen menstruierenden Frauen zwischen 15 und 20 Jahren beobachtet, die Tampons von bestimmten Marken verwendeten. Die menstruelle Vagina begünstigt die Toxinproduktion-und-Resorption, v.a. bei länger belassenen Tampons [14,45,97].

Es müssen bestimmte Bedingungen vorliegen, damit die TSST-1-Produktion stimuliert werden kann.

Ein Autor fand beim nicht-menstruellem TSS erhöhte Werte für O2, CO2, Proteine, Ca²*-Ionen, sowie Mg²*-Ionen, die scheinbar optimale Bedingungen für die TSST-Bildung bieten.

Das Toxin wird dann resorbiert, regt über eine Interaktion mit einem bestimmten Vß-Element von T-Zell-Rezeptoren die Bildung von Interleukin-2, sowie von Interleukin-2-Rezeptoren, mit nachfolgender Proliferation von T-Lymphozyten und Stimulation von Makrophagen zur Interleukin-1, Prostaglandinen und TNF-alpha-Produktion, die dann sekundär die klinische Symptomatik bedingen [49,76].

Ein Autor fand heraus, daß sich durch Einsatz eines Tampons der O2-Druck in der Vagina ansteigt und damit identisch ist mit dem atmosphärischen Druck. Dabei bietet die Vagina ein verändertes, optimaleres Mikro-Klima, das wahrscheinlich eine Rolle bei der Entstehung des menstruellen TSS spielt [98].

Das sogenannte menstruelle TSS tritt mit ca. 90% wesentlich häufiger auf als das nicht-menstruelle.

Kennzeichnend für das TSS sind ein abrupter Beginn mit Fieber, Schüttelfrost, schwerem Krankheitsgefühl, Kopfschmerzen, Myalgien, Erbrechen, Schwindel, hypotonen Kreislaufreaktion und Synkopen bis zum protrahierten Schock [76].

Innerhalb von 12 bis 24 Stunden tritt ein diffuses, scharlachartiges Exanthem auf, das sogar bis zur Erythrodermie führen kann.

Prädilektionsstellen sind dabei Palmae und Plantae sowie der Schultergürtel, der Kopfbereich bleibt meist ausgespart [33].

Nach Überwindung der akuten Schockphase kommt es nach ca. zwölf Tagen zu einer groblamellären Abschuppung der Haut, nach zwei bis drei Monaten kann es zu Haar und Nagelverlust kommen.

Die Letalität liegt bei ca. drei bis fünf Prozent und tritt häufig in den ersten drei Wochen auf [33].

Durch Abstrich aus Vagina und anderen Schleimhäuten gelingt der kulturelle Nachweis von TSST-1 bildenden Staphylokokken, der serologische Nachweis von TSST-1 Antikörpern ist auch möglich.

Ein TSS kann bei ausgedehnten Infekten mit S. aureus entstehen, sofern die Bakterien in der Lage sind Toxine zu produzieren und der Patient über keine ausreichende Abwehr verfügt.

Bereits niedrige Toxinkonzentrationen von einigen Picogramm pro ml reichen dabei schon aus, um das Krankheitsbild auszulösen.

Sogar eine lokal begrenzter Infekt kann zu einer Toxineinschwemmung im Körper führen, weil die Bakterien Toxinmengen im Bereich von vielen Mikrogramm produzieren [14].

Einige Autoren fanden heraus, daß neben dem TSST-1 auch die Enterotoxine B und C in der Lage sind ein TSS auszulösen, wobei bestimmte Phagentypen bevorzugt gefunden wurden.

Das Enterotoxin B wird bevorzugt beim Phagentyp V produziert und das Enterotoxin C vom Phagentyp 95 [45].

Die Enterotoxine A bis E können sind grundsätzlich als Verursacher von Lebensmittelintoxikationen verantwortlich gemacht werden, wobei die Toxine B und C zusätzlich jedoch in der Lage ein TSS auszulösen, jedoch in einem geringerem Maß als das TSST-1.

Es ist unklar, warum die anderen Enterotoxine(A,D und E) dazu nicht in der Lage sind [14].

Untersuchungen haben gezeigt, daß mehr als 40% der S. aureus Isolate ein oder mehrere Superantigene produzieren. Gleichzeitig sind aber auch Fälle bekannt in denen während eines TSS keine Superantigene nachgewiesen werden konnten.

Dies bedeutet, daß es neben den Superantigenen auch andere Ursachen für einen grampositiven Schock geben muß.

Bei einer grampositiven Sepsis ist es nun wichtig zu unterscheiden, welche Toxine ein S. aureus-Isolat bilden kann.

Konventionelle Methoden zum Nachweis von Enterotoxinen und TSST-1 aus Kulturüberständen sind z.B. Immundiffusion, Agglutination und Elisa-Testung.

Es ist aber anzumerken, daß diese Verfahren nicht immer als optimal anzusehen sind, wenn die in-vitro-Toxinproduktion sehr gering ist oder die Nachweisgrenze des Tests zu hoch ist und das gebildete Toxin so dem Nachweis entgeht.

Es ist auch möglich, daß ein Stamm zwar das Potential zur Toxinbildung hat, es aber aus irgendwelchen Gründen unterläßt und auf diese Weise dem Nachweis entgeht.

Zusätzlich ist zu bedenken, daß die Tests verschiedenen Einflüßen, wie z.B. Medium, pH, Temperatur usw. unterliegen und das Ergebniss dadurch verfälscht sein kann.

Dieses Problem kann durch den direkten Nachweis der Gene für die Enterotoxin B(seb), Enterotoxin C(sec) sowie TSST-1(tst)-Bildung umgangen werden [32].

Durch den Gennachweis kann man eine Aussage über das genetische Potential für das entsprechende Toxin und den Stamm machen, wobei man natürlich in dem Moment nicht beurteilen kann, ob das Toxin tatsächlich auch produziert werden kann.

Deshalb kann man auf zusätzliche Tests zurückgreifen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird eine PCR vorgestellt, mit deren Hilfe einzelne S. aureus Kolonien direkt von der Agarplatte ohne weitere Aufarbeitung verwendet und zu einem PCR-Ansatz hinzugefügt werden.

Dabei können die Gene seb, sec und tst gleichzeitig nachgewiesen werden.

Man kann so innerhalb von ca. 24 Stunden(der Keim muß anwachsen und danach eine PCR, mit anschließender Auftrennung mittels Gelelektrophorese durchlaufen) über die untersuchten Keime und deren genetisches Potential zur Toxinbildung eine Aussage machen.

Dagegen mußte man bei herkömmlichen Tests mindestens 48 Stunden und auch länger auf ein Ergebniss warten.

In einem weiteren Schritt unterzieht man die in der PCR eingesetzten Isolate einem Agglutinationsessay (Oxoid, der Fa. Unipath),mit deren Hilfe man eine Aussage über das Vorhandensein von Toxinen im Kulturüberstand machen kann.

Danach konnte man die Ergebnisse der PCR, die das Gen selbst nachweisen, mit den Ergebnissen der Agglutinationsessays vergleichen, die lediglich das Produkt des Gens nachweisen.

15. Zielsetzung der Arbeit:

Methicillin-resistente S. aureus werden im zunehmenden Maß als Verursacher von kompliziert verlaufenden Infekten isoliert. Es ist hierbei nötig, eine einfache, schnelle und auch gut diskriminierende Typisierungsmethode zur Hand zu haben, um sicher zwischen pathogenen und weniger pathogenen Keimen unterscheiden zu können.

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit liegt darin, eine Multiplex-PCR zum Nachweis von Staphylokokken, des Koagulase-Gen, sowie des mecA-Gens zu entwickeln.

Das zweite Ziel der Arbeit liegt darin, eine PCR zu entwickeln, die die Gene zur Enterotoxinbildung bei S. aureus nachweist.

Parallel wird die Enterotoxin-Bildung von S. aureus mittels herkömmlichen Reverse-Passive-Latex-Agglutinationstest(RPLA) aus Kulturüberständen nachgewiesen, wobei die Toxine B und C, sowie das TSST-1 als Verursacher des Toxic-shock-Syndrom dabei von besonderem Interesse sind. Die Ergebnisse beider Verfahren werden anschließend miteinander verglichen.

Das dritte Ziel der Arbeit liegt darin, in einem nachfolgendem Schritt beide PCR-Ansätze miteinander zu kombinieren und dadurch ein sogenanntes molekulargenetisches „Dendogramm“ eines Keimes erstellen zu können, das ergänzende Aussagen zu den konventionellen phänotypischen Typisierungsverfahren machen kann [72].

II. Material und Methoden:

1. Material :

1.1. Chemikalien:

Die während dieser Arbeit verwendeten Materialien sind im folgenden aufgeführt:

Agar Fluka(Deisenhofen)

Blut Charles River Wiga (Sulzfeld)

* Schafsvollblut in EDTA

DNase Agarplatten Boehringer Mannheim

EDTA Sigma (Deisenhofen)

Ethidiumbromid Biorad (München)

1 kb Marker Perkin Elmer

PCR-Nukleotid-Mix Boehringer Mannheim, Perkin Elmer

Enzyme:

DNA* AmpliTaq-Polymerase Perkin Elmer

1.2. Mikrobiologische und molekularbiologische Kits:

api-Staph® bioMerieux (Nürtlingen)

Bactident-Coagulase- Test® Merck

Bacto-Coagulase-Plasma-EDTA-Test® Difco (Augsburg)

Mikrobank ProLab (Ontario)

Set-RPLA-Test® (TD 900) Unipath

TST-RPLA-Test® (TD 940) Unipath

1.3. Laborgeräte:

Thermocykler

*2400®/ 9600® Perkin Elmer

Videodokumentation Intras (Göttingen)

1.4. Kunststoff und Einwegartikel:

Kunststoffartikel, Reaktionsbehältnisse und Mikrotiterplatten stammen von den Firmen Greiner (Nürtingen), Biozym (Oldendorf), Eppendorf (Hamburg) und Perkin Elmer.

1.5. Nährmedien:

Die Nährmedien wurden bei 20 min. bei ca. 121°C und 1,2 bar autoklaviert. Zur Herstellung von festen Nährmedien wurde die jeweils angegebene Menge Agar hinzugefügt.

Mueller-Hinton(MH)-Boullion und Agar

Die MH-Boullion (Unipath) wurde für den Agardiffusionstest verwendet mit folgender Zusammensetzung:

Pepton 30,0% [w/v]

Caseinhydrolysat 1,75% [w/v]

Stärke 0,15% [w/v]

Agar 1,7% [w/v]

pH 7,4

Für die durchgeführten Methicillin-Resistenzbestimmungen wurde dem Grundmedium 4% NaCl zugefügt.

Für die Kultivierung der S. aureus-Stämme wurde den MH-Agarplatten zusätzlich 10% (w/v) Schafsvollblut (Blutagar) zugesetzt.

Mannit-Bouillion (Difco)

Protease Pepton 10% [w/v]

NaCl 5% [w/v]

Mannit 10% [w/v]

0,2% ige Bromphenolblau-Lsg. 1,2% [w/v]

pH 7,4

Die Bouillion wurde 1h lang bei 100°C im Autoklav sterilisiert.

1.6. Bakterienstämme:

Eigenschaften und Herkunft der in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind im folgendem zusammengefaßt:

586 Staphylokokken-Isolate stammen von Patienten von verschiedenen Stationen der Uni-Klinik Düsseldorf bzw. aus umliegenden Krankenhäusern im Düsseldorfer Einzugsgebiet.

Diese waren vorher aus Blutkulturen, Punktaten, Tracheal-und Bronchialsekreten sowie Wundabstrichen gewonnen und dem Institut für „Medizinische Mikrobiologie und Virologie“ der Universität Düsseldorf zur Untersuchung zugeschickt worden.

Pro Patient wurde nur ein Isolat verwendet, um eine möglichst große Vielfalt zu gewährleisten.

Weitere 100 MRSA-Isolate stammen wiederum aus einer internationalen Kollektion, die von der Fa. Hoffmann LaRoche in Basel zur Verfügung gestellt worden war.

Hierbei gab keine näheren Informationen zu dem Probenmaterial.

Kontrollstämme:

S. aureus-ATCC-Stämme 12600, 13565, 19095, 25923, 29213, 33591, 33592 und 33593

S.epidermidis-ATCC-Stamm 27626

Tabelle 1: Übersicht über die eingesetzten Staphylokokken-Isolate:

Keim	MSSA	MRSA	Ursprung
S. aureus	n=195	n=193	Düsseldorf
		n=26	Japan
		n=23	Brasilien
		n=11	Schweiz
		n=5	Sri Lanka
		n=13	Spanien
		n=14	England
		n=8	Ungarn
S.epidermidis	n=50	n=54	Düsseldorf
S.simulans	n=11	n=10	Düsseldorf
S.haemolyticus	n=12	n=10	Düsseldorf
S.warneri	n=2		Düsseldorf
S.auricularis	n=6	n=7	Düsseldorf
S.sciuri	n=4	n=4	Düsseldorf
S.hominis	n=2	n=3	Düsseldorf
S.capitis	n=3	n=3	Düsseldorf
S.saprophyticus	n=2	n=3	Düsseldorf
S.cohnii	n=1	n=1	Düsseldorf
S.lugdunensis	n=4	n=4	Düsseldorf
S.schleiferi	n=1	n=1	Düsseldorf

1.7. Primerauswahl:

Für die PCR-Ansätze wurden Primer ausgesucht basierend auf publizierten Gensequenzanalysen, die im Bereich16-S rRNA-Genabschnitts, des coa-Gens bzw. des mecA-Gens binden und dementsprechend von der Fa. Pharmacia Biotech synthetisiert. Die Auswahl erfolgte mit dem Computerprogramm „DNA-Star“ (DNASTAR Inc. 96, Madison).

Die Primer wurden zunächst einzeln und dann alle gemeinsam in einem Multiplex-PCR-Ansatz eingestzt.

Multiplex-PCR:

mecA-Gen-PCR-Primer:

5`-Primer: 37- [5`]-GTTGTAGTTGTCGGGTTTGG- [3`]-66(20-mer)

3`-Primer:178- [5´]- CGGACGTTCAGTCATTTCTAC- [3´]-198(21-mer)

Das hierbei entstandene Amplifikationsprodukt weist eine Größe von 161 Basenpaaren auf.

coa-Gen-PCR-Primer:

5´-Primer: 1520- [5´]-GCTTCTCAATATGGTCCGAG- [3´]-1539(20-mer)

3´-Primer: 1631- [5´]-CTTGTTGAATCTTGGTCTCGC- [3´]-1651(21-mer)

Das hierbei entstandene Amplifikationsprodukt weist eine Größe von 131 Basenpaaren auf.

16S rRNA-Gen-PCR-Primer:

5´-Primer: 1170- [5´]-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT- [3´]-1189(20-mer)

3´-Primer: 1521- [5´]-AGGAGGTGATCCAACCGCA- [3´]-1539(19-mer)

Das hierbei entstandene Amplifikationsprodukt weist die Größe von 371 Basenpaaren auf.

16S rRNA-Gen-PCR:Nachweis für Staphylokokken:

5´-Primer: 294- [5´]-GCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGC- [3´]-318(25-mer)

3´-Primer:1522- [5´]-AGGAGGTGATCCAACCGCA- [3´]-1540(19-mer)

Das hierbei entstandene Amplifikationsprodukt weist eine Größe von 106 Basenpaaren auf.

PCR zum Nachweis der Toxine:

Die für den PCR-Ansatz benötigten Primer für die seb, sec und tst-Gene wurden entsprechend der Anweisungen der Fa. Pharmacia Biotech synthetisiert. Die Auswahl der Oligonukleotide erfolgte mit dem Computerprogramm „DNA-Star“ (DNASTAR Inc. 96, Madison).

seb-Gen-PCR-Primer:

5`-Primer:246-(5`)-GTATAAGAGATTATTTATTTCACATG-(3`)-271 (26-mer)

3`-Primer:451-(5`)-TATATTAAGTCAAAGTATAGAAATTG-(3`)-476 (26mer)

Das entstandene Amplifikationsprodukt weist die Größe von 231 Basenpaaren auf.

sec-Gen-PCR-Primer:

5`-Primer: 561-(5`)-CCACTTTGATAATGGGAACTTAC-(3`)-583 (23-mer)

3`-Primer: 808-(5`)-GATTGGTCAAACTTATCGCCTGG-(3`)-830 (23-mer)

Das entstandene Amplifikationsprodukt weist die Größe von 270 Basenpaaren auf.

tst-Gen-PCR-Primer:

5`-Primer: 51-(5`)-AAGCCCTTTGTTGCTTGCGAC-(3`)-71 (21-mer)

3`-Primer: 279-(5´)-AGCAGGGCTATAATAAGGACTC-(3`)-300 (22-mer)

Das entstandene Amplifikationsprodukt weist die Größe von 250 Basenpaaren auf.

2. Methoden:

2.1. Anzucht der Bakterien:

Man verwendete zur Anzüchtung der S. aureus-Stämme Müller-Hinton-Agar-Platten unter Zusatz von 10% Schafsblut.

Von bereits angezüchteten Stammplatten entnahm man jeweils eine Einzelkolonie und beimpfte damit eine Platte.

Nachfolgend wurden die angelegten Müller-Hinton-Agarplatten dann für ca. 24 Stunden bei 37° C kultiviert.

Diese Rein-Kulturen konnten dann für weitere drei Wochen bei 4°C gelagert werden, um dann für eventuelle Wiederholungen zur Verfügung zu stehen.

2.2. Stammbank:

Für längerfristige Konservierung der Bakterienstämme wurde nach Vorschrift des Herstellers eine sogenannte Mikrobank (ProLab) angelegt.

Die Gefäße zur Aufbewahrung der Stämme sind streng steril und enthalten kleine säurebehandelte Kügelchen mit poröser Oberfläche. An diese Kügelchen können sich nun Bakterien und ein spezielles Medium binden.

Die Bakterien-Stämme können dann für längere Zeit bei -70° C aufbewahrt werden und bei Bedarf entnommen werden.

2.3. Biochemische Identifikation:

Die Staphylokokken wurden zur Spezieseinteilung mehreren Identifikationsverfahren unterzogen, die im folgenden aufgelistet sind:

1)-Katalasereaktion

2)-Röhrchenkoagulase

3)-Nuklease(DNase)

4)-anaerobe Mannitspaltung

5)-biochemische Identifikation

Die isolierten Stämme wurden zunächst auf Mannitagar-und Blutagarplatten gleichmäßig ausgestrichen und danach wurden diese Platten bei 37°C im Brutschrank bebrütet.

Auf der Blutagarplatte erscheint S. aureus als mittelgroße, gelbe bis goldgelbe, manchmal auch weißliche Kolonien mit unterschiedlich ausgeprägter, bisweilen auch fehlender Hämolyse.

zu 1) Um festzustellen, ob die Katalase-Reaktion positiv war, wurden Bakterienkolonien des zu bestimmenden Isolats mit Wassestoffperoxid-Lösung verrieben. Wenn Katalase gebildet wird, spaltet sie die aufgetropfte Lösung zu Wasser und Sauerstoff ( 2 H₂O_{2 ¯}> 2 H₂O + O₂), diese positive Reaktion ist anhand der Schaumbildung erkennbar.

zu 2) Der Röhrchen-Koagulase-Test ermöglicht einerseits den Nachweis der freien, als auch der Zellgebundenen Koagulase, des sogenannten clumping factor.

Als Testverfahren wurden der Bacto-Coagulase-Plasma-EDTA-Test® (Difco) sowie der Bactident-Coagulase-Test® (Merck) eingesetzt.

Die Testung wurde nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Eine Agglutination wurde als positives Testergebnis befundet.

zu 3) Der Nuklease-Nachweis wurde mittels eines DNase-Agars drchgeführt.

Dafür wird zunächst eine Kolonie des zu untersuchenden Stamms zusammen mit einer Positiv-und einer Negativkontrolle auf einer DNA-haltigen Agarplatte mittels einer Impföse ausgestrichen. Das Testprinzip beruht auf der Hydrolyse der im Nährmedium vorhandenen DNA, wenn nun Dnase durch den S. aureus-Stamm gebildet wird.

Die Testplatte wird dann über Nacht bei 37° C bebrütet und am darauffolgendem Tag mit 1 M HCL benetzt. Auf diese Weise kann ungespaltene DNA durch Präzipitation als Trübung des Mediums dargestellt werden.

zu 4) Für die Testung auf anaerobe Mannitspaltung wurde Mannit-Boullion mit einer Bakterienkolonie beimpft, danach mit Paraffin beschichtet und über Nacht bei 37° C bebrütet.

Ein zugesetzter indikator zeigte bei Spaltung des Mannits einen Farbumschlag des Mediums von blau nach gelb.

zu 5) Zur Keimidentifizierung wurden die einzelnen Isolate mit Hilfe des api® Staph-Systems( bioMerieux) nach Anleitung des Herstellers als Staphylokokken identifiziert.

2.4. Resistenztestung:

Zusätzlich wurden die Stämme bezüglich ihres Resistenzverhaltens getestet. Die Testung erfolgte mittels Agar-Diffusionstest(nach DIN 58940) auf Mueller-Hinton-Agar (unter Zusatz von 2% NaCl).

Dafür wurden Testblättchen mit 5 µg Oxacillin pro Testblättchen auf vorher beimpfte Agaroberflächen aufgelegt. Danach wurden die Platten für 48 Stunden bei 30°C bebrütet. Anhand eines gebildeten Hemmhofes konnten die eingesetzten Bakterienstämme in „sensibel“oder „resistent“eingeteilt werden.

Hier wird auch trotz Einsatzes des Antibiotikums Oxacillin von „Methicillin-resistenten“ Staphylokokken gesprochen.

2.5. Multiplex-PCR:

Zur Etablierung der Multiplex-PCR wurden die bereits beschriebenen 586 nationalen Staphylokokken-Isolate und 100 internationalen MRSA-Isolate getestet.

Als Kontrolle dienten die ebenfalls bereits beschriebenen Kontroll-Stämme.

Mittels einer Pipettenspitze wurden singulär wachsende Baktereinkolonien direkt von der Agarplatte abgenommen und im unten aufgeführten Reaktionsansatz durch Unmrühren verteilt.

Für die Versuche wurden 24h alte Baktereinkulturen auf MH-Agar mit Zusatz von 10% Schafsblut verwendet.

Der PCR-Reaktionsansatz setzt sich folgendermaßen zusammen:

10 mmol Tris Hcl(pH 8,3), 50 mmol KCL, 2,5mmol MgCL2, 100 µmol dNTPs, je 0,4 µmol jedes Primers.

Das Reaktionsschema:

10 min. Denaturierungszeit von 94°C.

nach 5 min. 3 Units AmpliTaq-DNA Polymerase® in jedes PCR-Reaktionsgefäß hinzu(der sogenannte „hot-start).

Der Denaturierungsphase folgen 25 Zyklen, die sich auch aus mehreren Phasen zusammensetzen:

Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden,

Annealing bei 55°C für 20 Sekunden

und Extension bei 72°C für 50 Sekunden.

Anschließend erfolgt eine Inkubation bei 72°C für 5 Minuten, die sogenannte „Final-Extension“.

Die PCR selbst wurde in einem Gene-Amp PCR-Gerät 9200®der Fa. Perkin Elmer durchgeführt.

Durchführung:

Nach Ablauf aller PCR-Phasen wurden die PCR-Produkte je nach Fragmentgröße auf einem 1-3%igen Agarose-Gel in 1 x TBE-Puffer elektrophoretisch aufgetrennt. Es werden hierfür 20 µl des PCR-Ansatzes mit 3 µl Probenpuffer (30% Glyzerin, 0,1% BPB ) in die Geltaschen eines Agarosegels gefüllt.

Zur Bestimmung der Konzentration und der Größe der erhaltenen Fragmente wurde als DNA-Längenstandard einen 1 kb-Leiter (GibcoBRL), der jeweils in die erste und letzte Geltasche pipettiert wurde.

Durch den Zusatz von 0,1%iger Ethidiumbromidlösung zum Agarosegel konnten anschließend die Produkte nach elektrophoretischer Trennung mittels UV-Durchlicht (340 nm) sichtbar gemacht und photographisch mittels Modul-Digit-Store-Duo Geräts (Intras) dokumentiert werden.

Sensitivitätsprüfung:

Zur Überprüfung der Sensitivität der eingestzten Primer-Paare wurden zunächst alle o.g. eindeutig definierten Staphylokokken-Isolate zunächst einzeln untersucht und anschließend in Kombination mit den anderen Primern.

Es wurde geprüft, ob alle PCR-Produkte, die theoretisch detektierbar und amplifizierber wären auch tatsächlich exprimert werden, zunächst mit jedem Primer-Paar einzeln und dann im nächsten Schritt auch in Kombination.

Spezifitätsprüfung:

Zur Überprüfung der Spezifität der eingestzten Primer-Paare wurden neben den 686 Staphylokokken zusätzlich 50 andere gram-positive und gram-negative Isolate aus klinischen Probenaterial des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universität Düsseldorf zunächst mit jedem Primer-Paar einzeln und dann wieder im Kombination mit den anderen Primern.

Als weitere Überprüfung der Spezifität des 16S rRNA-Primers dienten Kolonien von n=10 Candida albicans-Isolaten.

2.6 Gelelektrophorese:

Eine einfache und schnelle Darstellung der PCR-Produkte stellt die Auftrennung der Amplifikate mittels der Gelelektrophorese dar.

Außer dem Nachweis der erfolgten DNA-Amplifikation kann man Aussagen über deren Auftrennung im einzelnen machen, ebenso kann man anhand der mitgeführten Größenstandards Aussagen bezüglich der Größe der entstandenen Amplifikate machen und ob es sich aufgrund der Größe auch um das zu erwartende Amplifikat handelt.

Weiterhin wird bei jedem Durchlauf eine sogenannte Positivkontrolle ( d.h. ein Referenzstamm, der garantiert das gesuchte Gen besitzt) und auch eine Negativkontrolle (d.h. eine Wasserprobe) mitgeführt.

Das Prinzip der elektrophoretischen Auftrennung beruht auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit der elektronegativ geladenen DNA-Fragmente in einer Elektrolytlösung unter dem Einfluß eines elektrisch geladenen Feldes.

2.7. PCR zum Nachweis der Toxine:

Es wurden insgesamt 100 internationale MRSA-Isolate auf das Vorhandensein der Gene für Enterotoxin B und C sowie des Toxic Shock Syndrom Toxin-1 (seb, sec1 und tst-Gen) getestet. Zusätzlich dienten zur Überprüfung des PCR-Ansatzes hinsichtich Spezifität und Sensitivität zusätzlich 50 Koagulase-negatige Isolate und 50 andere Eubakterein-Isolate aus nationalen Bestand.

Die Isolate sind bereits vorher beschrieben worden.

Die Primer-Paare wurden zunächst einzeln getestet und dann in Kombination mit den anderen.

Durchführung der PCR

Die eingesetzten Reagenzien sowie die Durchführung der PCR und Auftrennung der PCR-Produkte waren identisch mit dem bereits vorher beschriebenen Procedere bei der Multiplex-PCR mit nachfolgender Gelelektrophorese, die ebenfalls bereits beschrieben worden ist.

Sensitivitätsprüfung:

Zur Überprüfung der Sensitivität der eingesetzten Primer-Paare wurden zunächst alle o.g. eindeutig definierten Staphylokokken-Isolate zunächst einzeln untersucht und anschließend in Kombination mit den anderen Primern.

Spezifitätsprüfung:

Zur Überprüfung der Spezifität der eingesetzten Primer-Paare wurden neben den 100 MRSA-Isolaten zusätzlich 50 Koagulase-negative Staphylokokken und andere gram-positive und gram-negative Bakterienisolate aus klinischen Probenmaterial des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universität Düsseldorf zunächst mit jedem Primer-Paar einzeln und dann wieder im Kombination mit den anderen Primern.

2.8. Nachweis der Enterotoxine:

2.8.1 RPLA-Test:

Zum Nachweis der Enterotoxine B und C aus Kulturüberständen von S. aureus wurde der SET-RPLA-Test®(Oxoid Art.Nr. TD 900), für den Nachweis von TSST-1 Toxin der TST-RPLA-Test®(Oxoid Art.Nr. TD 940)der Fa.Unipath (Wesel) eingesetzt.

Das Testprinzip beruht auf der Reversen- Passiven-Latex-Agglutination. Es werden Polystyren-Latexpartikel mit aufgereinigten Antikörpern sensibilisiert, welche aus mit dem entsprechenden Enterotoxin immunisierten Kaninchen stammen.

In Gegenwart des entsprechenden Enterotoxins agglutinieren die Latexpartikel. Die Kontrolle erfolgt durch Latexpartikeln mit Globulinen aus nicht immunisierten Kaninchen.

2.8.2. Herstellung des Kulturüberstandes:

Die zu untersuchenden Isolate wurden für ca. 24 Stunden bei 37°C in 6 ml Caseinpepton-Sojamehlpepton-Lösung unter ständigen Schüttelbewegungen

inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz bei 4000 Upm (4°C) für 20 min. zentrifugiert. 25 mcl des Kulturüberstandes wurden in Kavitäten einer Mikrotiterplatte pipettiert. Der Test wurde dann laut Hersteller fortgeführt. Die Nachweisgrenze für die Enterotoxine liegt für die Toxine B und C bei 0,5 ng/ml und für das TSST-1 Toxin bei 2 ng/ml.

Wenn die Toxinmenge unterhalb dieser Grenzen lag, war es möglich, daß trotz Vorliegen der Toxine ein falsch negatives Ergebnis erzielt wurde.

Der Test wird in Mikrotiterplatten mit V-förmigen Vertiefungen durchgeführt.

In zwei Reihen der Vertiefungen werden Verdünnungen der Kulturflüssigkeit angelegt und mit den Latexsuspensionen vermischt.

Bei Vorliegen des zu bestimmenden Toxins kommt es zu einer Agglutination, die sich durch Bildung einer diffusen Netzstruktur zeigt. Wenn die Menge an gebildetem Toxin unter der Nachweisgrenze liegt oder gar kein Toxin produziert wird, bildet sich auf dem Boden der Vertiefung ein Sediment.

2.9. Integration der beiden Multiplex-Ansätze:

Die Multiplex-PCR zum Nachweis spezifischer PCR-Produkte für

1.) Eubakterien im phylogenetischen Sinne (allg.16SrRNA-Primer)

2.) Staphylokokken ( Staphylokokken-spezifische 16S rRNA-Primer)

3.) coa-Gen (coa-Gen-Primer)

4.) mecA-Gen (mecA-Gen-Primer)

wurde wie bereits oben beschrieben durchgeführt.

Die Primer zum Nachweis der seb, sec-1 und tsst-1-Gene wurden so ausgesucht, daß Amplifikationsprodukte einer bestimmten Größe entstanden (231nt, 270nt und 250nt), die sich mühelos in die bereits beschriebene Multiplex-PCR integrieren ließen ohne störende gegenseitige Überlappung.

Nachdem alle 200 Bakterienisolate zunächst mit jedem Primerpaar einzeln und dann in Kombination in einem Multiplex-Ansatz für den Nachweis der Toxin-Gene analysiert worden war, erfolgte anschließend der Einsatz in einem kombinierten Multiplex-PCR-Ansatz in Kombination aller sieben Primer-Paare.

Auch dabei wurde wie bereits vorher beschrieben die Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit der Methode überprüft.

Kapitel III.

Ergebnisse der Multiplex-PCR:

Entwicklung eines molekularbiologischen Verfahrens zur schnellen und validen MRSA-Detektion

1. Identifizierung von klinischem Untersuchungsmaterial:

Zur Verifizierung der Spezieszuordnung wurden alle in der Arbeit verwendeten Staphylokokken-Isolate unterschiedlichen konventionellen Identifikationsverfahren wie Katalasereaktion, Röhrchen-Koagulase, Nuklease (DNase), anaerober Mannitspaltung sowie einer biochemischen Identifikation unerzogen, wobei zusätzlich verschiedene ATCC-Stämme mitgeführt worden sind.

Für die nachfolgenden Untersuchungen kamen nur S. aureus-Stämme in Frage, die als positiv getestet wurden und eine anaerobe Mannitspaltung nachgewiesen werden konnte.

Stämme, die bei der Röhrchen-Koagulase-Testung als negativ getestet worden waren, wurden anschließend einer biochemischen Charakterisierung mittels api®-Staph unterzogen sofern die anderen drei Identifikationsreaktionen eine eindeutige Identifizierung als S. aureus erlaubten.

Die Einteilung in Methicillin-sensible und Methicillin-resistente S. aureus-Isolate erfolgte mit Hilfe des Agardiffusionstests.

2. Etablierung einer Multiplex-PCR zur Identifizierung von Bakterien mit Aussagen zur Taxonomie, Pathogenität und Methicillin-Resistenz bei Staphylokokken

Die Zahl der durch Methicillin-resistente S. aureus-Stämme ausgelöste Infekte stellt in Krankenhäusern und v.a. auf Intensivstationen ein wachsendes Problem dar.

Deshalb ist der Bedarf an Typisierungsverfahren, die schnell und zuverlässig Aussagen über den Verwandschaftsgrad einzelner MRSA-Isolate zueinander machen können sehr hoch, um frühzeitig adäquate therapeutische und hygienische Maßnahmen einleiten zu können.

Für die hier etablierte Multiplex-PCR wurden spezielle Primer ausgewählt, die den Nachweis spezifischer PCR-Produkte zur Einteilung der Isolate in Eubakterien im phylogenetischen Sinne, zur Detektion von Staphylokokken, zum Nachweis des Koagulase- [coa]-Gens, sowie des mecA-Gens ermöglichten [73].

Die einzelnen Primer-Paare zur Amplifikation von Gensequenzen der 16S rRNA aus Eubakterien bzw. Staphylokokken, sowie des mecA und coa-Gens wurden zunächst singulär hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität bei insgesamt 636 Eubakterien und 10 Candida albicans-Stämmen ausgetestet.

Die hierbei erzielten Resultate der einzelnen separat untersuchten PCR-Ansätze stimmen dabei vollständig mit überein mit den Resultaten der kombinierten Multiplex-PCR.

Die Resultate der Multiplex-PCR sind aus der Tabelle 2 ersichtlich.

Das für Eubakterien spezifische PCR-Produkt konnte in allen untersuchten Eubakterien und in keinem der Candida albicans-Stämme nachgewiesen werden.

Auch auch das für Staphylokokken spezifische 16S rRNA-PCR-Produkt konnte wie erwartet in allen Staphylokokken-Stämmen, jedoch nicht in den anderen Eubakterien oder Candida albicans-Isolaten nachgewiesen werden.

Mit dem mecA-Gen-Primer konnten bei 290 der insgesamt 293 Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus und bei 98 der insgesamt 100 Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen nachgewiesen werden.

In Fällen, wo der molekularbiologische Nachweis des Resistenzgens nicht mit den Ergebnissen des Agardiffusionstests übereinstimmte, wurde die PCR mehrmals wiederholt, wobei aber die ursprünglich erzielten Ergebnisse immer wieder reproduzierbar waren.

Mit dem für das coa-Gen-spezifischen Primer konnte wie erwartet nur in den S. aureus-Stämmen ein Amplifikationsprodukt erzielt werden.

Tabelle 2

KEIM:

S. aureus

KNS

EUBAKTERIEN

C.albicans

Methicillin-

Resistenz

MSSA n=195

MRSA n=293

MSSA n=98

MRSA n=100

n=50

n=20

16S rRNA

positiv

MSSA n=195

MRSA n=293

MSSA n=98

MRSA n=100

n=50

n=20

16S rRNA

negativ

MSSA n=0

MRSA n=0

MSSA n=0

MRSA n=0

n=0

n=20

SSG-

positiv

MSSA n=195

MRSA n=29

MSSA n=98

MRSA n=100

n=0

SSG-

negativ

MSSA n=0

MRSA n=0

MSSA n=0

MRSA n=0

n=50

n=20

coa-Gen

positiv

MSSA n=198

MRSA n=293

MSSA n=0

MRSA n=0

n=0

coa-Gen

negativ

MSSA n=0

MRSA n=0

MSSA n=98

MRSA n=100

n=50

n=20

mecA-Gen

positiv

MSSA n=3

MRSA n=290

MSSA n=2

MRSA n=98

n=0

mecA-Gen

negativ

MSSA n=192

MRSA n=3

MSSA n=96

MRSA n=2

n=50

n=20

Erläuterungen zu den in der Tabelle 2 benutzten Abkürzungen:

KNS=Koagulase-negative-Staphylokokken

S. aureus=Staphylococcus aureus

SSG= spezifisches PCR-Produkt zum Nachweis von Staphylokokken

MRSA= Methicillin-resistenter S. aureus

MSSA= Methicillin-sensibler S. aureus

16S rRNA=PCR-Produkt zum Nachweis von Eubakterien

Die Spezifität der vier möglichen PCR-Produkte konnte durch die exemplarische Sequenzierung je eines PCR-Produkts für alle vier amplifizierten Gensequenzen nachgewiesen werden.

Die sich aus den Ergebnissen ergebenden Spezifitäten und Sensitivitäten der jeweiligen Primerpaare lagen bei jeweils 100% bei den 16S rRNA-Primern, dem 16S rRNA-Primer für Staphylokokken und dem coa-Gen Primern, jedoch für die Primer des mecA-Gens bei 98%.

16S rRNA Eubakterium

16S rRNA

Staphylococcus

coa-Gen

mecA-Gen

Spezifität

100%

98%

Sensitivität

100%

98%

TABELLE 3 Vergleich Spezifität und Sensitivität der eingesetzten Primer

In der nachfolgenden Abbildung sind exemplarische Ergebnisse der Multiplex-PCR für die verschiedenen Isolate sowie eine H2O Kontrolle aufgeführt.

Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse war sehr gut, die spezifischen PCR-Produkte der untersuchten Staphylokokken ließen sich sowohl in der Einzeltestung als auch in der kombinierten Multiplex-PCR nachweisen.

Abbildung 3 Auftrennung der Amplifikationsprodukte der Multiplex-PCR in einem Agarosegel Spur 1 und 8 1 kb Längenstandard; Spur 2 Methicillin-sensible KNS; Spur 3 MSSA; Spur 4: Methicillin-resistente KNS; Spur 5: MRSA; Spur 6: E.coli; Spur 7: H2O-Probe

Die Pfeile geben die Größe der amplifizierten Fragmente an: 371 bp: Eubakterien spezifisches PCR-Produkt; 161 bp: mecA-Gen spezifisches PCR-Produkt; 131 bp: coa-Gen spezifisches Produkt; 106 bp: Staphylokokken spezifisches Produkt

3. Multiplex-PCR zum Nachweis der Gene seb, sec und tst

Die einzelnen Primerpaare zur Amplifikation von Gensequenzbereichen der seb, sec und tst-Gene wurden zunächst singulär ausgetestet hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität bei insgesamt 100 MRSA-Isolaten, 50 Koagulase-negativen und 50 anderen Eubakterienisolaten, anschließend wiederum in einem kombinierten Multiplex-Ansatz, wobei alle Ergebnisse reproduzierbar waren.

Das für das seb-spezifische PCR-Produkt wurde in allen 7 Enterotoxin B-produzierenden Isolaten gefunden. Ebenso konnte das für sec-spezifische Produkt in allen Enterotoxin C-bildenden Stämmen nachgewiesen werden, zusätzlich in 2 weiteren Isolaten, bei denen im Kulturüberstand kein Toxin C detektierbar war.

Das für das tst-spezifische PCR-Produkt fand sich nur in 17 TSST-1 synthetisierenden Isolaten.

TSST-1

(tst)

EntB

(seb)

EntC

(sec)

TSST-1/

EntC

TSST1

/EntB

EntB/

EntC

RPLA-Test

Toxin-PCR

Tabelle 4: Ergebnisse der PCR zum Nachweis der Toxine als Tabelle

Die aufgetrennten PCR-Produkte besaßen, gemessen am Längenstandard, folgende Größen:

seb zum Nachweis für das Enterotoxin B: 231 bp

sec zum Nachweis für das Enterotoxin C: 270 bp

tst zum Nachweis für das TSST-1: 250 bp

Die Ergebnisse der einzeln eingesetzten Primerpaare stimmten dabei mit den Resultaten der Multiplex-PCR komplett überein.

Zur Kontrolle der Spezifität wurden die Primerpaare zunächst einzeln ausgetestet.

Als Kontrolle wurde eine E.coli-Kolonie mitgeführt, wobei keine PCR-Produkt auftreten sollten.

Zur Kontrolle der Spezifität wurden die Primerpaare zunächst einzeln ausgetestet.

Wie erwartet ließ sich bei keinem der 50 Koagulae-negativen Staphylokokken und auch bei keinem der 50 Eubakterien-Isolate eines der für die Toxingene seb, sec und tst spezifischen Produkte.

Daraus ergibt sich für seb;- sec- und tst-Primer-Sets eine Spezifität und Sensitivität von 100 %.

Bei Ergebnissen, die nicht übereinstimmten, wurde das Testverfahren zur Kontrolle mehrfach wiederholt, wobei die ursprünglich erzielten Ergebnisse immer wieder bestätigt werden konnten.

Wenn die RPLA-Testung als Berechnungsgrundlage annimmt, erhält man für die seb, sec und tst-Primer-Paare eine Sensitivität und Spezifität von 100%.

Abbildung 4 : Auftrennung der Amplifikationsprodukte der kombinierten Multiplex-PCR

Spur 1 und 12: 1 kb Längenstandard; Spur 2: seb spezifisches PCR-Produkt (231 bp); Spur 3: tst spezifisches PCR-Produkt (250 bp); Spur 4: sec spezifisches PCR-Produkt (270 bp); Spur 5: Staphylokokken spezifisches PCR-Produkt; Spur 6: Staphylokokken und tst spezifisches Produkt; Spur 7: Staphylokokken und seb spezifisches PCR-Produkt; Spur 8: Eubakterien, Staphylokokken, tst und sec spezifisches PCR-Produkt; Spur 9: Spezifisches PCR-Produkt von Eubakterien, sec, tst, mecA, coa sowie von Staphylokokken; Spur 10: E.coli Kontrolle; Spur 11: H2O

4. Vergleich von konventionellen und molekularbiologischen Methoden zum Nachweis von Enterotoxinen und TSST-1 bei S. aureus:

S. aureus ist in der Lage Exotoxine zu bilden, die die Pathogenität des Keims mitbestimmen.

Die Detektion von Enterotoxinbildnern ist von großer Bedeutung, da sie als Verursacher von klinisch signifikant verlaufenden Staphylokokken-Sepsen auftreten können.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der konventionelle RPLA-Test mit dem molekularbiologischen PCR-Verfahren verglichen, wobei 100 S. aureus-Isolate der internationalen Stammsammlung hinsichtlich der Produktion von Enterotoxin B und C, sowie dem TSST-1 untersucht worden sind.

Mittels des RPLA-Tests, der auf einer Reversen passiven Latex-Agglutination beruht, wurde bei 24 der 100 S. aureus Stämmen die Produktion eines oder aber mehrerer Enterotoxine im Kulturüberstand nachgewiesen.

Bei 7 Stämmen konnte man das Enterotoxin B, bei 9 Stämmen das Enterotoxin C und bei 17 untersuchten Stämmen das TSST-1 nachweisen.

9 der 17 TSST-1 produzierenden Stämme produzieren auch Toxin C.

Es gab keine Isolate, die gleichzeitig Enterotoxin B und C produzierten.

TSST-1

(tst)

EntB

(seb)

EntC

(sec)

TSST-1/

EntC

TSST-1/

EntB

EntB/

EntC

RPLA-Test

Toxin-PCR

TABELLE 4: Vergleich der PCR zum Nachweis der Toxine und Latexagglutination

Tabelle 5 im Anhang zeigt die Ergebnisse der beiden Testungen im Vergleich.

Da der RPLA-Test durch Kulturbedingungen beeinflußbar ist, bietet der Nachweis der spezifischen Gene mittels PCR eine sensitivere Methode.

Mit der PCR konnten zusätzlich sechs Isolate identifiziert werden als Träger eines spezifischen Toxin-Gens, jedoch ohne Nachweis des Toxins im Kulturüberstand.

Dabei sollte bedacht werden, daß die PCR zwar die Spezifischen Gene nachweisen kann, diese jedoch „stumm“ sein können ohne phänotypische Expression.

5. Integration der beiden PCR-Ansätze in eine kombinierte Multiplex-PCR:

Um neben der schnellen Aussage zur Identifikation und zum Resistenzverhalten der eingesetzten Staphylokokken-Stämme auch Auskünfte über das potentielle Toxinbildungsverhalten machen zu können, wurde die PCR zum Nachweis der Toxine in die vorher beschriebene Multiplex-PCR integriert.

Der daraus resultiernde PCR-Ansatz enthielt sieben verschiedene Primerpaare zur Amplifikation von sec-, seb-, tst-, coa-,mecA-,sowie den 16S rRNA-Genfragmenten von Staphylokokken und Eubakterien.

Die Ergebnisse der Austestung der einzelnen PCR-Ansätze stimmten dabei überein mit den Ergebnissen der kombinierten Multiplex-PCR mit allen 7 Primerpaaren.

IV. Diskussion

1. Verschiedene Verfahren zur Typisierung von S. aureus

Es sind momentan schnelle, zuverlässige und kostengünstig arbeitende Verfahren zur Identifikation jener Isolate gefragt, die als Verursacher von nosokomialen Infekten in Frage kommen.

Es können nach wie vor die in der Standard-Routine-Diagnostik eingesetzten Verfahren, wie Koagulase-Testung oder Latex-Agglutinationstests, angewandt werden, aber oft ist die reine Identifikation eines Keims hierbei nicht mehr ausreichend, da viele Stämme bereits Multiresistenzen aufweisen können.

Weiterhin kommt es auch vor, daß es sich bei manchen Stämmen um sogenannte Grenzfälle handelt, die von den Routine-Methoden nicht erfaßt werden können und sich der Diagnostik erfolgreich entziehen oder aber falsch eingeschätzt werden bezüglich ihres Potentials.

Wie bereits vorher berichtet, hängt z.B. die Expression von Resistenz-Genen von den angebotenen Kulturbedingungen, wie pH-Wert, NaCl-Konzentration und Inkubationstemperatur des angebotenen Mediums ab [44].

Deshalb ist es aber wichtig, eine sorgfältige Bakterientypisierung vorzunehmen, um eine adäquate und auch prompte Therapie einzuleiten, sofern dies für nötig erachtet wird.

In verschiedenen veröffentlichten Studien wurde bereits über den Nutzen der PCR-Technik berichtet, wie z.B. beim Nachweis von Resistenzgenen, wie des mecA-Gens als Träger der Methicillin-Resistenz [6,8,16,20,23,24]

Bei fast allen Autoren war jeweils eine Vorbehandlung des eingesetzten Isolates nötig.

Bei der in der vorliegenden Arbeit etablierten Multiplex-PCR kann man unter Verwendung von geeigneten Oligonukletid-Primern Aussagen machen über die Zugehörigkeit der Isolate zu den Eubakterien, sowie deren Spezieszugehörigkeit.

Weiterhin kann man das Koagulase-Gen nachweisen, wodurch man die eingesetzten Isolate in die Gruppe der KNS oder S. aureus einordnen kann.

Der Nachweis des mecA-Gens weist auf einen Methicillin-resistenten Stamm hin, worauf entsprechende therapeutische Maßnahmen eingeleitet werden können.

Als interne Kontrolle wurden zusätzlich Oligonukleotid-Primer zum Nachweis der in allen Eubakterein konserviert vorliegenden 16S rRNA-Region eingesetzt, sowie für die Staphylokokken-spezifische 16S rRNA.

Die eingesetzten Kontrollen wiesen eine 100%ige Spezifität und Sensitivität auf.

Das Koagulase-Gen konnte ebenfalls in allen S. aureus-Isolaten nachgewiesen werden,während das mecA-Gen nur in 98% der als MRSA im Agardiffusionstest ausgewiesenen Stämme nachgewiesen werden konnte.

Als Erklärung hierfür könnten die bereits angesprochenen anderen Resistenzmechanismen angeführt werden. Umgekehrt detektierte man bei zunächst als MSSA eingestuften Isolaten ein mecA-Genprodukt.

Diesen Tatbestand könnte man mit der Beeinflußbarkeit der phänotypischen Resistenzausbildung durch exogenen Faktoren, wie Inkubationstemperatur usw., erklären. Ebenso könnten aber auch Spontanmutationen im mecA-Gen selbst oder deren regulatorischen Elementen dafür verantwortlich sein.

Man setzt vier Oligonukleotid-Primer-Paare ein und kann bereits nach Ablauf von vier Stunden Aussagen über Taxonomie, Resistenzverhalten und Pathogenität eines Keims liefern.

Die PCR lieferte konstante Ergebnisse, die unbeeiflußt blieben von Kulturbedingungen und war in der Lage zwischen intrinsischer-und auch borderline-Resistenz zu unterscheiden.

Voraussetzung dabei ist natürlich eine Abnahme des Materials unter sterilen Bedingungen, da Kontaminationen zu falschen Ergebnissen führen können.

Probleme können derzeit bei Blutproben oder mit Blut kontaminierten Proben auftreten, da bei der Lyse entstehendes Hämoglobin zu unspezifischen Ergebnissen führen kann.

2. Entwicklung von molekulargenetischen Verfahren zur schnellen und validen Detektion bei MRSA-Isolaten

MRSA gewinnen zunehmend an Bedeutung, da sie immer häufiger als Verursacher von ernsthaft verlaufenden nosokomialen Infekten beobachtet werden, wobei besonders hospitalisierte und immunsupprimierte Patienten betroffen sind.

Um ein schnelles und effizientes Eingreifen zu ermöglichen steigt der Bedarf an Detektionsverfahren zur schnellen und zuverlässigen Erkennung und Diskriminierung von sowohl Koagulase-negativen und -positiven als auch von Methicillin-sensiblen und -resistenten Staphylokokken-Isolaten.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird eine Multiplex-PCR vorgestellt und evaluiert, die den Einsatz einzelner Bakterienkolonien ohne vorhergehende Präparation direkt von der Agarplatte für den PCR-Ansatz ermöglicht.

Anschließend können nach Ablauf von vier Stunden detaillierte Aussagen über Zugehörigkeit des vorliegenden Isolates zu den Eubakterien und seiner Spezieszugehörigkeit, weiterhin über Pathogenitätsmerkmale, wie Koagulaseproduktion und Resistenzverhalten gemacht werden.

Im Gegensatz zum Agardiffusionstest ist die PCR relativ unabhängig von Temperatur, pH-Wert und Salzkonzentration.

Als zusätzlicher Pluspunkt ist die Unterscheidung, ob eine intrinsische oder aber borderline Methicillin-Resistenz vorliegt möglich mittels der Multiplex-PCR, was mögliche therapeutische Konsequenzen nach sich zieht, da „borderline“-resistente Keime auf ß-Lactamantibiotika ansprechen, jedoch die Isolate mit der durch das mecA-Gen vermittelten Resistenz mit anderen Antibiotika adäquat therapiert werden können.

In den meisten PCR-Ansätzen, die im Rahmen der mikrobiologischen Diagnostik von Staphylokokken durchgeführt worden sind, erfolgte vor Beginn des Ansatzes eine DNA-Extraktion bzw. eine Vorinkubation mit Enzymen.

Nur Hedin und Löfdahl setzten S.epidermis-Kolonien zum Nachweis des mecA-Gens ohne vorhergehende Behandlung direkt von der Agarplatte ein, wobei die Ergebnisse vergleichbar waren mit Versuchen mit vorheriger Extraktion oder Enzymbehandlung [93].

Im hier beschriebenen Multiplex-Ansatz werden die Bakterienkolonien ebenfalls direkt von Agarplatte ohne vorherige Präparation eingesetzt, was eine enorme Vereinfachung des Procedere darstellt.

Ein großer Vorteil der Multiplex-PCR liegt in der Tatsache, daß gleichzeitig mehrere

PCR-Ansätze bearbeitet werden können.

Um die Anzahl der falsch negativen Ergebnisse so niedrig wie möglich zu halten, ist der Einsatz einer Positivkontrolle erforderlich bei dem hier vorgestellten Verfahren und dafür wurde als interne Kontrolle die Amplifikation von 16S rRNA-Sequenzen aus konservierten Genregionen gewählt, die in allen Eubakterien nachweisbar sind.

So deutet das Nicht-Vorhandensein diese 16S rRNA-Amplifikationsprodukts beim Einsatz von Bakterien darauf hin, daß eine fehlerhafte Amplifikation von Zielsequenzen vorliegen muß, die von einem „unkorrekten“ PCR-Ansatz

herrühren.

Es können entweder nicht optimale Konzentrationen der eingesetzten Reagenzien, zuwenig oder aber zuviel Template-DNA eingesetzt worden sein, ein falsches Programm ausgewählt worden sein oder aber Pipettierfehler ursächlich vorliegen.

Wird in einem Ansatz die 16S rRNA-Gensequenz nicht amplifiziert, so muß der komplette Ansatz wiederholt werden.

Die in der beschriebenen Multiplex-PCR eingesetzten Primer zum Nachweis der 16S-rRNA-Produkts bei Eubakterien weisen eine Spezifität und Sensitivität von 100% auf.

Weiterhin bildet die Amplifikation des Staphylokokken-spezifischen Gens eine interne Kontrolle zur Klärung der Frage, ob im PCR-Ansatz genügend DNA-Material vorhanden ist.

Als positiver Nebeneffekt ist dadurch eine indirekte Kontrolle der Zell-Lyse möglich, da v.a. Koagulase-negative Staphylokokken bekanntlich teilweise nur schwer einer Lysebehandlung zugänglich sind.

Die Spezifität und Sensitivität der hier eingesetzten Primer liegt bei 100%, was für den Einsatz bei der Staphylokokken-Untersuchung spricht.

Zusätzlich können anhand der Diskriminierung weitere Aussagen zum Grad der Pathogenität gemacht werden, um ein schnelles und effizientes Eingreifen von Seiten des behandelnden Arztes ermöglichen zu können sofern notwendig.

Maslow stellt folgende Forderungen an das optimale Verfahren zur Typisierung von Staphylococcus aureus: Die Methode muß optimal typisieren können, die Ergebnisse müssen reproduzierbar sein, müssen gut diskriminieren können, einfach in der Handhabung sein und die Ergebnisse sollten einfach zu interpretieren sein [83].

Für die Einleitung einer adäquaten Therapie bei Vorliegen einer S. aureus Infektion

ist der schnelle Nachweis einer potentiellen Methicillin-Resistenz von hoher Bedeutung, da MRSA-Isolate häufig nicht nur gegenüber allen ß-Lactamantibiotika sind, sondern auch häufig bereits multiresistent sind, d.h. es sind bereits Resistenzen gegenüber den bis dahin noch wirksamen Antibiotikaklassen wie der Aminoglykoside und Gyrasehemmer (62,95).

Zusammenfassend erhält der Untersucher mittels der hier vorgestellten Multiplex-PCR sehr schnell zuverlässige Informationen bezüglich der Identität des Keims und Anhaltspunkte fürs weitere Procedere und das Verfahren kann entweder als Ergänzung oder Aternative zu den herkömmlichen klassischen Testungen fungieren.

Momentan wird das Verfahren nicht Routinemäßig und auch nicht in automatisierter Form angewandt, kann aber in Zukunft noch an Bedeutung zunehmen.

3. Vergleich von Methoden zum Nachweis von Enterotoxinen und TSST-1

Wie bereits beschrieben ist S. aureus in der Lage verschiedene Enterotoxine zu produzieren.

Bei jedem Infekt, bei dem Bakterien die Enterotoxine B,C und das TSST-1 bilden können und gleichzeitig kein ausreichend hoher Schutztiter vorliegt ist die Inzidenz der Entwicklung eines TSS erhöht.

Bei ausgedehnten Infekten ist eine Aussage über das Toxin-Bildungs-Potential eines Stammes wichtig, um das Risiko für den Patienten an einem TSS zu erkranken, besser einschätzen zu können.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die Expression der Enterotoxine B und C, sowie das TSST-1 mittels eine Latex-Agglutinationstests aus Kulturüberständen von 100 internationalen S. aureus-Isolaten bestimmt.

Der RPLA-Test wies in 24% der eingesetzten S. aureus-Isolate eines der Toxine nach, wobei diese Ergebnisse tendenziell mit den Untersuchungsergebnissen von Lehn et al. [40] übereinstimmten.

Das bedeutet, daß unter bestimmten Bedingungen jeder vierte Stamm durch Toxin-bildung ein TSS auslösen kann. Daneben spielen höchstwahrscheinlich auch noch andere Faktoren neben den Superantigenen bei der Ausbildung des TSS eine Rolle.

Konventionelle Methoden zum Nachweis von Enterotoxinen und TSST-1 in Kulturüberständen sind z.B. die Immundiffusion, Agglutination und das Elisa-Verfahren, wobei diese Verfahren als sehr zeitaufwendig und durch multiple Testbedingungen sehr störanfällig sein kann.

Außerdem können im Rahmen immunologischer Verfahren kreuzreagierende Antigene falsch-positive Resultate erzeugen.

Diese Probleme können durch den direkten Nachweis der seb-, sec- und tst-Gene umgangen werden, da durch das entsprechende nachgewiesene Gen der eingesetzte Keim grundsätzlich das Potential zur Toxinbildung innehat, was jedoch nicht gleichbedeutend mit tatsächlicher Expression sein muß.

Es wurde im Rahmen dieser Arbeit eine PCR entwickelt, die ebenfalls Bakterienkolonien direkt von der Agarplatte verwendet und die Toxinbildenden Gene direkt nachweist. Es wurden dabei das seb, sec und das tst-spezifische PCR-Produkt in allen Toxin-produzierenden Stämmen nachgewiesen.

Lediglich ein weiterer tst-spezifischer und zwei sec-spezifische PCR-Produkte wurden zusätzlich in den phänotypisch als Toxin-negativ ausgewiesenen Isolaten nachgewiesen.

Für diese Diskrepanz können mehrere Erklärungen angeführt werden. Es ist möglich, daß die Test-Sensitivität eine Rolle spielt, wenn z.B. zu geringe Mengen an Toxinen gebildet werden und somit von dem Test nicht mehr erfaßt werden [29,48]. Weiterhin können Mutationen im agr-Gen zu einer fehlenden Expression der Toxine führen.

Bei der Auswahl der Primer wurde darauf geachtet, daß keine Homologien zwischen den einzelnen Genen als Primertarget dienten.

Für das Enterotoxin C sind Epitop-Unterschiede beschrieben worden, so daß drei unterschiedliche Typen unterschieden werden können [39].

Diese Tatsache wurde bei der Auswahl der Primer wurde diese Tatsache berücksichtigt, damit alle drei möglichen Ausprägungstypen vom Primer miterfaßt werden konnte.

Im Vergleich zeigt die PCR zum Nachweis der Toxine eine höhere Spezifität und Sensitivität als die konventionelle RPLA-Testung.

Zudem ist die RPLA-Testung viel anfälliger, weil sie durch veränderte Kulturbedingungen beeinflußt werden kann und außerdem viel zeitaufwendiger ist [97].

Die PCR erlaubt dagegen eine einfache und schnelle Detektion von Toxin-bildenden Genen, ohne Rückschlüße auf deren tatsächliche Expression.

Der Nachweis der Gene zeigt nur, daß der Stamm theoretisch über das Toxinbildungspotential verfügt, macht aber keine Aussage darüber, ob das tatsächlich der Fall ist.

Auf jeden Fall sollten Toxin-Gen-positive S. aureus-Isolate aus klinischen Gründen grundsätzlich als potentielle Toxinbildner angesehen werden, auch wenn keine in vitro-Toxinbildung nachgewiesen werden kann, da sie das Potential zur Toxinbildung besitzen und die Produktion jederzeit eingeschaltet werden kann.

Die in der vorliegenden Arbeit beschriebene-PCR zum Nachweis der Toxine wurde in die ebenfalls beschriebene Multiplex-PCR in einer kombinierten Multiplex-PCR integriert. Auf diese Weise erhält man viele Informationen über ein Isolat.

Diese kombinierte PCR ist nun in der Lage ein Isolat als S. aureus zu identifizieren, seine Resistenzsituation zu klären sowie einen Aussage über sein Toxinbildungspotential zu machen.

Daraus kann der behandelnde Arzt entscheidende Rückschlüsse über das weitere therapeutische Procedere ziehen.

Die Feststellung der Resistenz ist natürlich nur in Zusammenhang mit der kompletten Spezies-Differenzierung und weiterer Pathogenitätsmerkmale interessant, wie hier z.B.der Staphylokkoken-spezifischen-Koagulase.

Zwei Arbeitsgruppen amplifizierten mittels einer Multiplex-PCR parallel zunächst einmal das mecA-Gen, das femA-Gen bzw. ein Staphylokokken-spezifische Sequenz und dann das mecA-Gen zusammen mit dem 16S rRNA-Gen. In diesen Arbeiten war jedoch immer eine Vorinkubation und eine DNA-Extraktion der eingesetzten Staphylokokken-Isolate nötig [20,90].

In der hier erarbeiteten Multiplex-PCR können Bakterienkolonien ohne vorherige Aufarbeitung direkt von der Agarplatte im PCR-Ansatz eingesetzt werden, was eine enorme Zeit-und finanzielle Ersparnis bedeutet.

Die erarbeitete PCR ermöglicht mit einem einzigen Reaktionsansatz innerhalb von 4 Stunden Aussagen über Taxonomie, Pathogenität sowie Resistenzverhalten eines bestimmten isolierten Staphylokokken-Isolates zu machen.

Das PCR-Verfahren hat auch Nachteile, es können z.B. verfälschte Ergebnisse auftreten, wenn die Primer nicht sorgfältig nach bestimmten Kriterien, die im Kapitel II bereits beschrieben wurden, ausgewählt werden. Außerdem muß die flankierte Gensequenz ebenfalls nach bestimmten Gesichtspunkten erwählt worden sein und nach Möglichkeit nicht zu viele identische Basenabfolgen bieten, da es zur Ausbildung von nicht erwünschten Produkten in Form von sogenannten „Geisterbanden“kommt.

Bestechend ist jedoch die leichte Durchführbarkeit, ohne aufwendige Vorpräparation der eingesetzten Keime und der Zeitfaktor.

Die PFGE ist zwar in der Lage noch exakter als die PCR-Technik Isolate zu differenzieren und wird somit als „Goldstandard“ [95] bezeichnet, jedoch ist zu bedenken, daß die Durchführung mehrere Tage in Anspruch nehmen kann.

Leider fehlt es bei der PFGE und auch bei der PCR an gänzlich standarisierten Protokollen, um eine Vergleichbarkeit innerhalb der Laboratorien zu gewährleisten

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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Entwicklung von PCR-Verfahren zur schnellen Differenzierung, Resistenzbestimmung und Pathogenitätseinstufung von Staphylokokken

Als Inauguraldissertation gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Inhaltsverzeichnis

Kapitel I

Einleitung

RPLA-Test