C. und O. Vogt-Institut für Hirnforschung Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. K. Zilles
VIP-immunreaktive Neurone im primär-somatosensorischen Kortex der adulten Ratte: Immunzytochemische Charakterisierung und dreidimensionale Rekonstruktion
Dissertation
Der Medizinischen Fakultät der Tan Bayraktar 2000
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Als Inauguraldissertation gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der
gez.: Prof. Dr. Häussinger
Referent: Prof. Dr. Zilles Korreferent: Prof. Dr. Luhmann
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Eine elektronische Version dieser Dissertation ist unter
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Inhaltsverzeichnis:
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Seit über einem Jahrhundert ist die einzelne Nervenzelle als elementares Glied der neuronalen Informationsverarbeitung ein zentraler Gegenstand der Hirnforschung. Wenngleich angesichts technologischer Fortschritte und verfeinerter funktioneller Untersuchungsmethoden die Physiologie von Nervenzellen und Nervenzellverbänden in den Vordergrund gerückt worden ist, ist nach wie vor die Gestalt einer Nervenzelle von unzweifelhafter Relevanz für das Verständnis ihrer Funktion. Thema dieser Dissertationsarbeit ist es, eine bestimmte Population von Nervenzellen aufgrund ihrer Gestalt in Beziehung zu bestehenden funktionellen Entitäten zu setzen und anhand dieser Beziehung weitere Aussagen über die Funktion dieser Nervenzellen herzuleiten. Die Zellen sind charakterisiert durch Immunreaktivität mit Antikörpern gegen Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP; die Zellen werden im Folgenden VIP-Zellen oder VIP-Neurone genannt), das von ihnen produziert wird, um es vermutlich als stoffwechsel- und neuromodulatorische Substanz in den Extrazellulärraum freizusetzen. Neben anderen Lokalisationen kommen sie im gesamten Neokortex vieler Säugetiere [3,34,55,62,91] und auch des Menschen [13,30,66] vor. Für diese Arbeit wurden ausschließlich VIP-Zellen aus dem primär-somatosensorischen Kortex der adulten Ratte untersucht.
Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) ist erstmals von Said und Mutt aus dem Duodenum des Schweines isoliert worden [75]; seinen Namen verdankt es seiner dilatierenden Wirkung auf die Gefäße des Magen-Darm-Traktes. Neben weiteren Lokalisationen innerhalb des Verdauungsapparates, oft in Assoziation mit cholinergen Fasern des autonomen Nervensystems [53], findet man VIP unter anderem auch innerhalb des zentralen Nervensystems, und dort vor allem in der Hirnrinde [55]. Innerhalb des Kortex kommt VIP überwiegend in streng vertikal zur Pia ausgerichteten, bipolaren Nervenzellen vor. In ihrer Ausdehnung erstrecken sich VIP-Zellen oftmals über mehrere kortikale Schichten [25,39,62]. Diese Eigenschaft ist hinweisend auf eine integrative Funktion der Zellen im funktionellen Gefüge von kortikalen Kolumnen, vertikal angeordneten Zellverbänden, die durch vergleichbar geartete Reaktionen auf einen Stimulus verifizierbar eine relative funktionelle Einheit bilden [63,88]. Neben diesen morphologischen Auffälligkeiten tragen zahlreiche mit VIP in Verbindung gebrachte physiologische Effekte zum Interesse an den Zellen bei. VIP wird kalziumabhängig aus der Zelle freigesetzt [59]; Rezeptoren für diese Substanz befinden sich auf Nervenzellen, Astrozyten und Gefäßwänden [60]. Spezifische Antagonisten von VIP sollen existieren [36]. Die Axonterminalen von VIP-Zellen zeigen eine deutliche Assoziation mit kortikalen Blutgefäßen [21]. Physiologische Experimente wiesen auf eine Dilatation von hirneigenen Gefäßen nach Gabe von VIP hin und bekräftigten die Vorstellung, dass VIP-Zellen sich an der Durchblutungsregulation im Kortex beteiligen [41,61], im Zusammenspiel mit anderen Systemen, wie zum Beispiel dem aus dem Nucleus basalis Meynert aufsteigenden cholinergen Fasersystem [27,92]. Insbesondere der Arbeitsgruppe um Magistretti ist es zu verdanken, dass zahlreiche andere modulierende Einflüsse von VIP auf den Hirnstoffwechsel beleuchtet worden sind. Ihre Experimente führten zu dem Schluss, dass VIP synergistisch mit Noradrenalin das
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intrazelluläre cAMP in kortikalen Nervenzellen und Astrozyten erhöhen kann mit der Konsequenz einer Mobilisierung von Glykogen und einer Erhöhung des Zellstoffwechsels [58]. Durch die komplementäre Lokalisation von VIP in kortikalen Zellen mit streng lokalem Einfluss einerseits und von Noradrenalin in den Kortex umfassenden, aufsteigenden Fasern aus dem subkortikalen Locus coeruleus andererseits ist es vorstellbar, dass neben einer globalen Aktivierung des Kortex durch Noradrenalin VIP-Zellen diese Aktivierung noch einmal streng lokal, dem Bedarf entsprechend, im Sinne von "Hot spots" steigern und feinregulieren können [57]. Synapsen zwischen noradrenergen Fasern und VIP-Neuronen sind vor kurzem elektronenmikroskopisch nachgewiesen worden [67] und lassen eine Interaktion zwischen dem noradrenergem Fasersystem und dem lokalen VIP-System vermuten. Erwähnenswert ist außerdem, dass VIP die Verstärkung der Expression von BDNF (brain-derived neurotrophic factor) [69] und die Förderung des embryonalen Wachstums und des überlebens von Nervenzellen [15,37,65,70] zugeschrieben wird. Somit scheint VIP in der Regulation von unterschiedlichen Stoffwechselvorgängen innerhalb des Nervengewebes eine bedeutsame Rolle zuzukommen. Im Verhältnis zu den stoffwechselaktiven Funktionen von VIP sind die neuromodulatorischen Eigenschaften dieses Polypeptids bislang wenig beachtet worden. An Neuronen ist VIP in der Lage, die Wirkung anderer, klassischer Neurotransmitter zu modulieren, wiederum synergistisch mit Noradrenalin, aber auch mit Acetylcholin [64,76], das in einem Drittel aller VIP-Zellen zusätzlich produziert wird [10,20]. Ferner bedeutsam ist die Erkenntnis, dass alle VIP-Zellen im Neokortex zugleich auch (-Aminobuttersäure (GABA), den wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im ZNS, enthalten [10,44,71] und somit selbst inhibitorisch wirksam sind. Betrachtet man alle den VIP-Zellen zugeschriebenen Funktionen, sowohl die stoffwechselaktivierenden wie auch die neuromodulatorischen und inhibitorischen Eigenschaften, liegt es nahe, in VIP-Zellen eine wirksame Instanz zur Anpassung allgemeiner kortikaler Aktivität, dem Bedarf in einem bestimmten kortikalen Abschnitt entsprechend, zu sehen.
Der primär-somatosensorische Kortex der Ratte Der primär-somatosensorische Kortex der adulten Ratte (S1, im folgenden Par1 nach der Nomenklatur von Zilles und Wree [103]) [93], ebenso wie der der Maus [100] und anderer Nagetiere [87], besitzt eine Architektur, die es gestattet, funktionell fassbare kortikale Kolumnen mit Hilfe von morphologischen Mitteln zuverlässig abzugrenzen. Ein parallel zur Pia mater geführter Schnitt (diese Schnittrichtung wird im Folgenden als tangential bezeichnet) durch Schicht IV läßt bereits im nach Nissl gefärbten Standartpräparat ein honigwabenähnliches Muster von Flächen mit einer erhöhten Zelldichte in der Granulärschicht erkennen [93] (Abb. 1). Diese Flächen, in der Literatur gängig als Barrels bezeichnet, werden voneinander durch hellere Streifen, den Septa, getrennt, deren Zelldichte der des übrigen Kortex entspricht [93]. Das Barrel-Muster hat dem primär-somatosensorischen Kortex der Ratte den Namen Barrel-Kortex eingebracht. Die Anordnung der zelldichten Barrels im Tangentialschnitt ähnelt weitgehend der Anordnung der langen Tasthaare der Ratte, den Vibrissen, auf der kontralateralen Seite ihrer Schnauze, in somatotoper Entsprechung [6,96,100] (Abb. 1).
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Die Vibrissen stellen die wichtigsten Tastorgane der Ratte dar. Durch aktives Bewegen der Vibrissen ist die Ratte in der Lage, ihre nächste Umgebung in sehr sensibler Weise tastend zu erfassen. Physiologische Experimente haben gezeigt, dass ein Barrel in einer bestimmten Position innerhalb des Barrel-Feldes den stärksten sensorischen Stimulus aus dem Tasthaar in entsprechender Position innerhalb des kontralateralen Vibrissenfeldes erhält [6,77,95,102]. Gleichartige, ebenfalls morphologisch darstellbare Somatotopien sind für das Kerngebiet des Nervus trigeminus [9,31] und den Nucleus ventralis posteromedialis thalami [51] beschrieben. Nervenzellen oberhalb und unterhalb eines Barrels in Par1 lassen sich ebenfalls aufgrund ihrer Reaktion auf einen peripheren Stimulus dem gleichen Tasthaar zuordnen [7,77,95]. Diese Beobachtungen führten zu der Auffassung, dass es sich bei den Schicht-IV-Barrels um morphologische Korrelate von kortikalen Kolumnen handelt. Entsprechend werden im Folgenden die Rindenbereiche oberhalb und unterhalb eines Barrels zusammen mit dem dazugehörenden Barrel in der Granulärschicht (Schicht IV) als Barrel-Kolumne zusammengefasst (Abb. 2). Ebenso wird das Kortexgewebe oberhalb und unterhalb eines Septums als septale oder Septum-assoziierte Kolumne bezeichnet. Es bestehen Hinweise dafür, dass sich das Wesen einer Barrel-Kolumne als neuro-funktionelle Einheit auch in ihrer Gefäßversorgung niederschlägt. So ist das Gefäßnetz in den Barrels dichter als in den Septa [26,68], und die Reizung von bestimmten Vibrissen scheint selektiv den Blutfluss in den entsprechend zugeordneten Barrels zu erhöhen [26].
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Barrels lassen sich außer mit der Nissl-Färbung auch darstellen, indem man die Aktivität von Enzymen des Energiemetabolismus, beispielsweise der Cytochromoxidase [5,32,73], aber auch der Succinat-Dehydrogenase [45], sichtbar macht. In den Barrels endet der größte Teil spezifischer somatosensorischer Afferenzen aus dem Nucleus ventralis posteromedialis des Thalamus als ein dichtes Netz von Fasern [54,84,94]. Diese starken Afferenzen führen zu einem gesteigerten Stoffwechsel in den Dendriten der nachgeschalteten kortikalen Neurone innerhalb der Barrels [98], im Gegensatz zu den umgebenden Bereichen, die keine spezifischen thalamokortikalen Afferenzen erhalten. Darüberhinaus hat sich herausgestellt, dass die synaptischen Boutons thalamokortikaler Afferenzen zahlreiche Mitochondrien enthalten [85]. Cytochromoxidase, ein mitochondriales Enzym der Atmungskette, kann deshalb innerhalb der Boutons und der afferentierten Dendriten in erhöhter Aktivität nachgewiesen und mit Hilfe einer histochemischen Reaktion sichtbar gemacht werden [98]. Der spezifische Vorteil gegenüber der Darstellung der Barrels durch die Nissl-Färbung liegt in der diskreteren Färbung der Strukturen als Hintergrund, der mit anderen Zellen, die zum Beispiel durch eine Immunreaktion dargestellt werden können, relativ wenig interferiert. Aufgrund seiner herausragenden morphologischen Architektur hat sich der Barrel-Kortex als beliebtes Versuchsobjekt und Modell zur Untersuchung des kortikalen Informationsflusses und zur Plastizität von Kolumnen etablieren können [4,7,72,96]. Als primär-sensorisches Hirnrindenareal ist der Barrel-Kortex frühzeitig in den Verarbeitungsprozess taktiler Informationen eingebunden. Das Muster der Barrels ermöglicht es, funktionell zusammenhängende, die ganze Dicke des Kortex umfassende, kolumnäre Zellverbände mit einfachen morphologischen Mitteln abzugrenzen. Dabei stehen Befunde zur Verfügung, die es gestatten, den voneinander differenzierbaren Kompartimenten des Barrel-Kortex, nämlich den Barrels und Septa zusammen mit den damit assoziierten Kolumnen (Abb. 2), unterschiedliche Funktionen innerhalb der kortikalen Datenverarbeitung zuzuordnen. So werden die Barrels als eine informationsverarbeitende Station in einem Datenfluss mit spezifischem, stark somatotopem Inhalt gesehen. Die vorgeschalteten Relaisstellen mit somatotoper Ordnung zwischen Vibrissenfeld und Neokortex sind das Trigeminus-Kerngebiet (insbeondere der Nucleus principalis nervi trigemini) und der Nucleus ventralis posteromedialis thalami [22,23,48]. Im Gegensatz dazu erhalten die Barrel-Septen unspezifischere Informationen, die auf dem Weg vom Vibrissenfeld zum Kortex überwiegend im Subnucleus interpolaris nervi trigemini und danach im Nucleus posterior thalami weitergeschaltet worden sind [22,23,48]. Auch hinsichtlich der Efferenzen unterscheiden sich die Neurone in den Barrels von denen in den Septen. Während die intrinsischen Axone der Zellen in einer Barrel-Kolumne lokal weitgehend begrenzt bleiben und ihre Projektionen innerhalb des Barrel-Kortex über die jeweils unmittelbar benachbarten Barrel-Kolumnen nicht hinausgehen [46], bilden Zellen in Septum-assoziierten Kolumnen horizontale Axonkollateralen aus, die über mehrere Barrels hinweg andere septale Kolumnen erreichen [46,72]. Die Darstellung dieser intrinsischen Faserverbindungen auf Tangentialschnitten durch Schicht IV des Barrel-Kortex führt zu einem Bild, in dem die Barrels von Fasern verhältnismäßig ausgespart sind [72].
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Zielsetzung der Arbeit: Rekonstruktion von VIP-Zellen im Barrel-Kortex Zilles und Mitarbeiter [104] haben an der Maus gezeigt, dass die Anordnung von VIP-immunreaktiven Strukturen innerhalb des Barrel-Kortex, wie schon für GABAerge Zellen im Allgemeinen beschrieben [24], in einer bestimmten örtlichen Beziehung zu einzelnen Barrels steht. Demzufolge sind VIP-immunreaktive Strukturen in den Barrel walls, bestehend aus dem Septum und den bei der Maus Barrel sides genannten peripheren Bereichen der Barrels [100], relativ konzentriert im Gegensatz zu den eher lichteren Barrel-Zentren [104]. Es ist zu vermuten, dass mit diesem spezifischen Verteilungsmuster eine funktionelle Assoziation von VIP-Neuronen und Barrels einhergeht. Gelänge der Nachweis dieser Assoziation, ließe sie sich möglicherweise auch auf andere Bereiche des Kortex extrapolieren, die ebenfalls kolumnären Organisationsprinzipien unterliegen, auch wenn diese morphologisch nicht so einfach zu erfassen sind wie anhand der Barrels im primär-somatosensorischen Kortex. VIP-Zellen sind bereits in unterschiedlichen Hirnrindenarealen rekonstruiert worden, so vor allem im primär-visuellen Kortex der Ratte [25] und der Katze [91] sowie dem motorischen Kortex [43,71] und dem Hippocampus der Ratte [1]. Komplette Rekonstruktionen insbesondere des Axonbaumes von VIP-Zellen aus dem primär-somatosensorischen Kortex der Ratte hingegen standen noch aus. Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit war es daher, die räumliche Beziehung von VIP-Zellen zu Barrels durch Einzelzellrekonstruktionen zu beleuchten. VIP-Zellen wurden durch Immunhistochemie dargestellt und mit Hilfe einer konventionellen Camera lucida, überwiegend aber dreidimensional mit einem Computermikroskop und der kommerziell vertriebenen Software Neurolucida 2.1 (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) [35] rekonstruiert. Auf den gleichen Hirnschnitten wurden Barrels durch Darstellung der Cytochromoxidaseaktivität der Präparate sichtbar gemacht. Die räumliche Beziehung der Zellen zu den Barrels wurde durch computergestützte Rotation und Betrachtung der Rekonstruktionen aus unterschiedlichen Blickrichtungen ermittelt. Im Folgenden werden wesentliche Unterschiede zwischen VIP-Neuronen, die sich in unterschiedlichen Schichten des Isokortex befinden, aufgezeigt. Außerdem soll dargestellt werden, in welchem Ausmaß sich die Lokalisation einer VIP-Zelle in Beziehung zu einem Barrel in der Gestalt und Ausdehnung der Zelle niederschlägt. Rückschlüsse von der Gestalt auf die Funktion der Nervenzellen werden erörtert und diskutiert. Wesentliche Teile dieser Dissertationsarbeit sind bereits veröffentlicht worden [11,12].
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Ausgewachsene männliche Wistar-Ratten (n=7, Körpergewicht zwischen 250-300 g) wurden durch eine überdosis intraperitoneal injizierten Pentobarbitals betäubt und durch die Aorta ascendens mit einer Lösung aus 4% Paraformaldehyd und 0,2% Pikrinsäure in 0,1-molarem Phosphatpuffer (PP) perfundiert. Die Hirne wurden herauspräpariert und mit einem Vibratom in 50 µm dicke Serienschnitte geschnitten. Die Schnittrichtung entsprach bei vier Tieren der von Standard-Koronarschnitten. Die Gehirne der drei anderen Tiere wurden parallel zu einer Ebene geschitten, die senkrecht zu den Barrel-Reihen (engl. Barrel rows, Abb. 1) und parallel zu den Barrel-Bögen (engl. Barrel arcs) orientiert war und eine klare Abgrenzung von Barrels und den Septa dazwischen gestattete [93] (Abb. 3). Nach ausgiebiger Spülung in PP wurde das Gewebe für die Dauer von einer Stunde in ein Kryoprotektivum aus 25% Saccharose und 10% Glyzerol in 0,01-molarem PP getaucht. Danach wurde es dreimal sequenziell über flüssigem Stickstoff gefroren und wiederaufgetaut. Anschließend wurden die Schnitte mehrere Male in PP und danach in TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TPS, 0,05 M, pH 7,4) gespült.
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Nach Präinkubation in normalem 10%igem Ziegenserum (Vector, Burlingame, USA; in TPS, pH 7,4) wurde das Gewebe 36-48 Stunden lang dem Primärantikörper gegen VIP (von Dr. T. Görcs [38] im Kaninchen gewonnen und großzügig zur Verfügung gestellt) bei 6° C ausgesetzt. Anschließend wurden die Schnitte viermal 15 Minuten lang in TPS gespült und zwei
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Stunden lang dem Sekundärantiserum mit biotinilierten, gegen Kaninchenproteine gerichteten Antikörpern von der Ziege ausgesetzt. Nach erneuter Spülung in TPS (pH 7,4; viermal 15 Minuten) wurde das Gewebe für die Dauer von zwei Stunden in einen Avidin-biotinilierten Meerrettichperoxidase-Komplex (ABC; 1:200; Vector) getaucht. Die Inkubation wurde durch eine weitere Spülung der Schnitte beendet, zunächst zweimal 15 Minuten lang in TPS (pH 7.4), dann zweimal 15 Minuten lang in 0,05 M TRIS-Puffer (TP; pH je nach weiterer Prozedur 8,2 für DAB-Ni oder 7,6 für einfaches DAB). Der TP wurde ersetzt durch 1 ml/Gläschen einer Chromogen-Lösung, hergestellt entweder aus 7,5 mg 3'-3-Diaminobenzidin-4HCl (DAB; Sigma, München) und 200 mg Nickelammoniumsulfat (Fluka, Schweiz) in 50 ml TP, oder aus einfachem DAB in TP (5 mg/10 ml). Nach abgeschlossener Präinkubation wurde die färbende Peroxidase-Reaktion gestartet, indem den Schnitten eine geeignete Menge an H2O2 zugefügt wurde. Die Reaktion wurde nach Erreichen einer angemessenen Färbeintensität der Nervenzellen durch mehrfaches Spülen der Hirnschnitte in TP (pH 8,2 bzw. 7,6) wieder beendet. Schließlich wurde das Gewebe noch zweimal 10 Minuten lang in PP (0,1 M; pH 7,4) gespült.
Auf dem Gewebe, das senkrecht zu den Barrel-Reihen geschnitten worden war, wurden nach Beendigung der Immunhistochemie die Barrels mit Hilfe von Cytochromoxidase-Histochemie dargestellt. Dazu wurde das Färbeprotokoll nach Wong-Riley [97] mit geringen Modifikationen wie folgt angewandt: Die Hirnschnitte wurden in eine Inkubationslösung aus 6 mg Cytochrom C, 5 mg DAB und 444 mg Saccharose in 10 ml PP bei 37° C getaucht. Die Inkubation wurde beendet, als das braune Reaktionsprodukt in einer Intensität vorlag, die es einerseits gestattete, Barrels abzugrenzen, und andererseits optisch nicht mit den zu rekonstruierenden Nervenzellstrukturen interferierte. Die DAB-Färbung der Schnitte wurde intensiviert durch eine Lösung aus 1% OsO4 und 7% beta-D-(+)Glukose in 0,1 M PP. Nach 45 Minuten wurden das OsO4 entfernt und die Schnitte erneut in PP gespült. Anschließend wurde das Gewebe in einer aufsteigenden Ethanol-Reihe entwässert, mit zwischengeschalteter Immersion der Schnitte in Uranylacetat nach dem 70%-Ethanol-Schritt. Schließlich wurde das Gewebe in Propylenoxid getaucht, in Durcupan (ACM, Fluka, Schweiz) über Nacht eingebettet und anschließend auf Objektträger aufgezogen, gedeckelt und bei 60° C unter Kompression 16 Stunden lang ausgehärtet.
Auf sieben mit der Cytochromoxidase-Reaktion gefärbten Schnitten von drei Tieren wurde mit Hilfe eines Computer-Mikroskops und der Software Neurolucida (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) [35] der primär-somatosensorische Kortex nachgezeichnet. Unter Anwendung eines Objektivs mit zehnfacher Vergrößerung wurden alle innerhalb einer Fokusebene erkennbaren VIP-Zellen in die entsprechenden Zeichnungen eingefügt. Das Rindengebiet wurde anhand des Cytochromoxidase-Reaktionsmusters seiner Tiefe nach in unterschiedliche Bereiche eingeteilt, nämlich in 1.) die supragranulären Schichten, 2.) die Granulär-
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schicht, in der wiederum a) Barrels und b) Septa abgegrenzt werden konnten, sowie 3.) die infragranulären Schichten (Abb. 2). Die Grenzen dieser Bereiche wurden ebenfalls den Zeichnungen hinzugefügt. In dieser Art wurden von jedem der sieben Hirnschnitte drei unterschiedliche Zeichnungen angefertigt, um den bei der Abgrenzung der Bereiche auftretenden Variabilitäten Rechnung zu tragen. Mit Hilfe der Berechnungssoftware Morph (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) wurden auf jeder der einundzwanzig Zeichnungen die Flächen der oben genannten Bereiche des primär-somatosensorischen Kortex berechnet und die Anzahl der in diesen Bereichen gelegenen VIP-Zellen ermittelt. Die Mittelwerte einander entsprechender Flächen und Zellzahlen der drei Zeichnungen von jedem Hirnschnitt wurden gebildet. Für die weitere Berechnung wurden nur diese Mittelwerte herangezogen. Zum besseren Vergleich der einzelnen Rindenbereiche wurden die Zelldichten als Verhältnis zwischen der Anzahl der Zellen und der Fläche des Bereichs, in dem die Zellen lokalisiert waren, berechnet [Anzahl der Neurone / mm²].
In einem frühen Stadium dieser Untersuchung wurden VIP-Neurone (n=12) von koronaren Serienschnitten ohne vorhergehende Darstellung der Barrels durch eine Cytochromoxidase-Reaktion mit Hilfe einer konventionellen Camera lucida abgezeichnet. Alle weiteren in diese Arbeit eingegangenen VIP-Zellen (n=51) wurden von mit einer Cytochromoxidase-Reaktion gefärbten Serienschnitten an einem Computer-Mikroskop unter Verwendung der Neurolucida-2.1-Software (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) rechnergestützt dreidimensional rekonstruiert. Die für diese Aufgabe benutzten Geräte sind in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Das Kernstück ist ein Lichtmikroskop, dessen Objekttisch mit Hilfe dreier Elektromotoren präzise von einem sogenannten Stage-Controller entlang der drei Achsen des Raumes bewegt werden kann. Der Stage-Controller wiederum kann manuell durch einen Joystick oder automatisch während der Zellrekonstruktion durch den angeschlossenen Computer angesteuert werden. Zum Rekonstruieren einer Zelle ist es erforderlich, das Abbild des Präparates und die Zeichnung mit dem Zeicheninstrument, dem Zeichencursor des Computerprogramms, gleichzeitig und übereinander projiziert darzustellen. Dazu stehen zwei alternative Möglichkeiten zur Verfügung. Zum einen kann das Abbild des mikroskopischen Präparates durch eine in den Strahlengang des Mikroskopes eingeschaltete CCD-Kamera in den Computer gespeist und durch diesen dargestellt werden. Der Untersucher zeichnet dann am Monitor die Umrisse des Präparates mit Hilfe der Computermaus ab (Abb. 4, 6).
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Alternativ wird das Computerbild mit geöffnetem Neurolucida-Programmfenster durch einen in den modifizierten Zeichenarm einer konventionellen Camera lucida eingebauten Mikromonitor in den Strahlengang des Mikroskopes eingeblendet (Lucivid). Der Untersucher sieht dann beim Blick ins Okular des Mikroskops sowohl das Präparat als auch das Neurolucida-Applikationsfenster zusammen mit dem Zeichencursor (Abb. 5). Bei beiden Systemen bewegt der Computer über den Stage-Controller den Objekttisch weiter, sobald der aktuell eingestellte Präparateausschnitt abgezeichnet ist, so dass lückenlos am nächsten Ausschnitt weitergezeichnet werden kann. Die Zellen werden von der Software als Objekte gespeichert, die aus Verbindungslinien definierter Dicke zwischen Punkten in einem dreidimensionalen Koordinatensystem gebildet werden (Abb. 6). Beide geschilderten Systeme kamen im Rahmen der vorliegenden Arbeit zur Anwendung.
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Zur Rekonstruktion wurden insbesondere solche Zellen ausgewählt, die sich in der Nähe der Grenze einer Barrel-Kolumne befanden, um eventuelle Asymmetrien in der Gestalt einer Zelle aufzuzeigen, die sich möglicherweise aus dieser Nähe ergaben. Erwies sich eine Zelle im Verlauf der Untersuchung als offensichtlich nur sehr unvollständig rekonstruierbar, so wurde diese Zelle nicht weiterverfolgt, sondern ignoriert. Die Anzahl der in den unterschiedlichen kortikalen Schichten rekonstruierten VIP-Neurone wurde ursprünglich so gewählt, dass sie im Verhältnis der Anzahl der Zellen entsprach, die während der Zellkartierung in der gleichen Schicht ermittelt worden war. Um bestimmte Kennzeichen der VIP-Neurone in der Granulärschicht und in den infragranulären Schichten näher zu beleuchten, wurden in diesen Schichten allerdings relativ mehr Zellen rekonstruiert, als man nach der ursprünglichen Vorgabe erwarten sollte. Insgesamt wurden 63 VIP-Zellen rekonstruiert, von denen sich 27 (entsprechend 43%) in den supragranulären Schichten, 12 (19%) in der Granulärschicht, 23 (37%) in den infragranulären Schichten und 1 Zelle in der weißen Substanz befanden. Um eine möglichst
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vollständige Rekonstruktion der Nervenzellen zu gewährleisten, wurden die Fortsetzungen von Zellfortsätzen und Perikarya, die an der Schnittoberfläche unterbrochen worden waren, im Folgeschnitt aufgesucht und weiterverfolgt. Dabei diente das Muster von Gefäßprofilen an der entsprechenden Stelle als Orientierungshilfe, um die Fortsetzung einer bestimmten, verfolgten Struktur eindeutig als solche zu identifizieren. Zur Auswertung wurden die Zellrekonstruktionen mit Computerprogrammen wie z.B. der Maxsim-Simulationssoftware [89], Neurotate (kommerziell vertrieben durch Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) oder Convax (T. Bayraktar, Freeware) der Orientierung auf Tangentialschnitten entsprechend rotiert. Angestrebt wurde dadurch eine genauere Beurteilbarkeit der räumlichen Beziehung der rekonstruierten VIP-Neurone zu den Barrels, die ebenfalls auf den Dateien abgebildet waren. Die in dieser Dissertationsarbeit abgebildeten Zellen wurden mit Neurolucida rekonstruiert, unter Verwendung der Software Convax 2.02 (T. Bayraktar, Anhang) in ein gängiges Metafile-Format konvertiert und mit dem Zeichenprogramm CorelDraw! 6.0 (Corel Corporation, Canada) bearbeitet und ausgedruckt, um eine möglichst authentische Darstellung der Zellen zu erreichen.
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![]() Abb. 6
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Die oben beschriebene Versuchsanordnung ergab Serienschnitte, auf denen die VIP-immunreaktiven Strukturen klar und zusammenhängend rekonstruierbar waren (Abb. 7, 8), und auf denen andererseits das Barrel-Muster nach der Cytochromoxidase-Reaktion hinreichend deutlich erkennbar war. Die Cytochromoxidase-Reaktion gestattete eine sichere Unterscheidung zwischen supragranulären und infragranulären Schichten und der dazwischen liegenden Granulärschicht mit differenzierbaren Barrels und Septa (Abb. 7). Eine genauere Abgrenzung des isokortikalen Schichtenmusters war hingegen schwer möglich, da das Erfordernis von Serienschnitten für die möglichst vollständige Rekonstruktion von VIP-Zellen die Färbung von einzelnen Schnitten einer Serie nach Nissl nicht gestattete. Eine Unterscheidung zwischen den infragranulären Schichten V und VI wurde, sofern erforderlich, grob durch den Vergleich mit Nissl-Schnitten von anderen Tieren vorgenommen.
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![]() Abb. 7
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![]() Abb. 8
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VIP-Neurone fanden sich in allen kortikalen Schichten und in der untergelagerten weißen Substanz. Von den immunhistochemisch und durch die Cytochromoxidase-Reaktion doppelgefärbten Schnitten wurden insgesamt 1818 VIP-Zellen aus allen kortikalen Schichten kartiert. 48% davon befanden sich in den supragranulären Schichten, 16% in Schicht IV und 36% in den infragranulären Schichten (Abb. 9). Von den Zellen der Granulärschicht befanden sich 7% innerhalb der Barrels und 9% außerhalb davon in den Septa. Auch die Zelldichte, errechnet als Anzahl von VIP-Zellen innerhalb einer Fokusebene pro Quadratmillimeter Gewebefläche, war bei allen Tieren in den supragranulären Schichten am höchsten. Die Zelldichte in den supragranulären Schichten wurde daher auf 100% festgelegt. Bezogen auf die supragranulären Schichten betrug die Zelldichte in der Granulärschicht 62%. Dabei wiesen die Septa mit 75% der Zelldichte der supragranulären Schichten einen höheren Wert auf als die Barrels (51%). Die Zelldichte war am niedrigsten in den infragranulären Schichten (44%). VIP-Zellen aus den kortikalen Schichten II-VI und der weißen Substanz wurden zur Rekonstruktion ausgewählt. Die Verteilung von 35 der rekonstruierten Zellen im räumlichen Verhältnis zu zwei benachbarten Barrels ist in Abbildung 7 dargestellt.
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Die Gestalt von Soma und Dendriten der VIP-Zellen im primär-somatosensorischen Kortex der Ratte entsprach in ihren Grundzügen weitgehend den Berichten aus anderen Hirnrindengebieten (siehe Einleitung). Aufgrund der somatodendritischen Morphologie wurden die folgenden VIP-Zellklassen unterschieden (Abb. 10):
In einer Stichprobe von 150 VIP-Zellen aus fünf Tieren war die Zusammensetzung wie folgt: Bipolare, einfach gebüschelte und zweifach gebüschelte Neurone stellten mit 76% den größten Anteil der Population. 14% der VIP-Zellen waren tripolare oder modifiziert-bipolare Neurone, 7% waren multipolar und 3% fielen durch Eigenschaften auf, die keiner der übrigen Zellklassen zugeordnet werden konnten. Insgesamt wiesen VIP-Zellen eine große Formenvielfalt auf, wenngleich die meisten Zellen bipolarer oder gebüschelter Art waren (Abb. 10). Aufgrund der vertikalen Orientierung ihres im Durchschnitt 750 µm langen Dendritenbaumes erstreckten sich viele VIP-Zellen mit ihren Dendriten über mehrere kortikale Schichten. Dies traf aufgrund der geringeren Dicke der Kortexschichten vor allem für die Zellen in den Laminae II-IV zu. Viele dieser VIP-Neurone besaßen ein oder zwei Dendriten, die dem apikalen Pol des Perikaryon entsprangen und weitgehend unverzweigt durch die Schichten II/III zogen, um sich dann in der Molekularschicht mehrfach dichotom aufzuzweigen. Ein auffälliges und regelmäßig auftretendes Merkmal dieser äste in Schicht I war das Vorkommen von perlschnurartig aufgereihten, großen, runden Varikositäten (Abb. 13, 14, 15, 21). Im Gegensatz dazu verzweigten sich die Dendriten, die dem der weißen Substanz zugewandten Pol der Zellen entsprangen, weiter proximal in Nähe des Somas und besaßen ein vielfältigeres Aussehen.
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Obwohl auch hier dendritische Varikositäten auftraten, waren sie weitaus weniger regelmäßig geformt und auch nicht in der typischen perlschnurartigen Weise wie in Schicht I angeordnet. In seiner horizontalen Ausdehnung war der Dendritenbaum von VIP-Neuronen in den meisten Fällen begrenzt. In den Schichten, in denen sich die Dendriten aufzweigten, erreichte der Dendritenbaum in der Tangentialebene einen Durchmesser von durchschnittlich etwa 235 µm in den Schichten I-Va. Mit circa 290 µm im Mittel etwas breitere Dendritenbäume fanden sich vor allem im unteren Abschnitt der infragranulären Schichten. Da ein Dendritenstamm jedoch über größere Strecken unverzweigt verlaufen konnte, war das Einzugsgebiet der Dendriten allerdings oftmals nur in umschriebenen Bereichen derart weit, wie zum Beispiel in der Molekularschicht (Abb. 13, Zelle a). Zellen mit einer größeren horizontalen Ausdehnung der Dendriten wichen oft von dem geschilderten morphologischen Grundmuster ab, zum Beispiel dadurch, dass das Neuron zwar bipolar, aber horizontal oder schräg orientiert war (Abb. 14, Zelle b; Abb. 15, Zelle a). Einige der VIP-Neurone waren im Verlauf ihrer Dendriten locker mit Dornen (Spines) besetzt (Abb. 18, Zelle c). Eine klare Zuordnung von Spines zu bestimmten oben genannten Zelltypen konnte allerdings nicht vorgenommen werden.
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Das Axon von VIP-Neuronen entsprang meist proximal in Nähe des Somas einem der Dendritenstämme oder etwas seltener dem Perikaryon selbst. Der Verlauf des Axonhauptstammes war weit überwiegend senkrecht zur pialen Oberfläche, also vertikal orientiert (Abb. 11). Die meisten Zellen, insbesondere in den supragranulären und den infragranulären Schichten, besaßen deszendierende Axone, die tiefer gelegene Bereiche des Kortex innervierten (Abb. 14, 15, 19, 20). Aufgrund des horizontal kaum kollateralisierenden, deszendierenden Axonbaumes waren viele VIP-Zellen in den supragranulären Schichten Double-bouquet-Zellen vergleichbar (Abb. 14), wenn sie auch nicht alle dieser Zellgruppe zugewiesenen Merkmale, insbesondere der Dendriten, aufwiesen [79]. Deszendierende Axonkollateralen von VIP-Zellen näherten sich vielfach vertikal orientierten Dendriten von anderen VIP-Zellen in tieferen Schichten und bildeten mit diesen zusammen oft mehr als 100 Mikrometer lange Bündel mit vermutlich zahlreichen axodendritischen Synapsen. Dieses Phänomen war vor allem im großenteils der Schicht V entsprechenden Abschnitt der infragranulären Schichten zu beobachten. Nichtsdestoweniger besaßen etwa 30% der untersuchten Zellen primär aszendierende, zur Pia hin strebende Axone, vor allem im unteren Abschnitt der supragranulären Schichten und in der Granulärschicht sowie, wenn auch weitaus seltener, in den infragranulären Schichten (Abb. 16, 17, 19). Einige dieser Zellen in den Schichten II-IV wiesen besondere Regelmäßigkeiten in ihrer Gestalt auf, die Anlass dazu gaben, sie als einen speziellen Zelltyp aufzufassen, der bisher nicht der Population der VIP-Zellen zugeordnet worden ist. Das Perikaryon dieser Zellen befand sich entweder in Schicht IV oder im unteren Abschnitt der supragranulären Schichten und wies zwei, manchmal drei Dendritenstämme auf, die ihm entsprangen (Abb. 16). Der vom apikalen Zellpol entspringende Dendritenstamm teilte sich in einer Entfernung vom Perikaryon von nicht mehr als 100 µm dichotom, die äste folgten einem schrägen Verlauf. Das Axon hatte seinen Ursprung entweder unmittelbar an der Bifurkationsstelle oder etwas weiter proximal, stieg zunächst vertikal auf, bog dann aber am Scheitel des Axonbaumes haarnadelförmig ab, um vertikal zu deszendieren. Während dieses Verlaufes bildete der Axonstamm mehrere Kollateralen aus, die jeweils bogenlampenartig deszendierten (Abb. 11, 16). Dendriten und Axon dieser Zellen boten somit den Aspekt einer Fontäne oder einer Trauerweide, was nahelegt, diese VIP-Neurone deskriptiv als fontänen- oder trauerweidenartig (engl. fountain- oder weeping-willow-like) zu bezeichnen. Aufgrund dieses axonalen Verzweigungsmusters und der Lokalisation von Axon und Dendriten überwiegend in den Schichten III und IV scheinen diese Zellen geeignet, in Schicht IV eingehende neuronale Signale in einen in tangentialer Richtung sehr umschriebenen Bereich unmittelbar darüber weiterzuleiten (Abb. 11, 16).
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Im gesamten Barrel-Kortex bildeten VIP-Axonkollateralen gelegentlich korbartige Anlagerungen um die Zellkörper von VIP-Neuronen und oft auch um nicht angefärbte Zellkörper aus (Abb. 8). Obwohl die Axone einiger der rekonstruierten Zellen einzelnen Perikarya anderer Zellen wiederholt sehr nahe traten und dabei diese umwickelnd perisomatische Körbe ausbildeten, ist es nicht gelungen, eine umschriebene Gruppe von Korbzellen innerhalb der Population von VIP-Neuronen auszumachen. Dazu war die Anzahl der von einzelnen Axonbäumen gebildeten perisomatischen Körbe zu gering. Ebensowenig gelang es, von perisomatischen Körben ausgehend das Axon zur Ursprungszelle bis zum Initialsegment retrograd zurückzuverfolgen, obwohl das einige Male versucht worden ist. Eine mögliche Ursache hierfür ist die unvollständige Darstellung des Verlaufs der Axonkollateralen infolge ihrer Myelinisierung.
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Schichtenabhängige Unterschiede zwischen den Zellen, räumliche Beziehung zu Kolumnen Einige morphologische Eigenschaften sowohl der Dendriten als auch der Axone von VIP-Neuronen im primär-somatosensorischen Kortex wiesen eine deutliche Abhängigkeit von der Lokalisation des Perikaryons innerhalb der isokortikalen Schichten auf. Aufgrund dessen wurden zwei heterogene Gruppen von VIP-Neuronen mit unterschiedlichen Lokalisationen oberhalb und unterhalb einer unscharfen, durch die Schicht V gezogenen horizontal verlaufenden Linie differenziert. Hinsichtlich der Ausdehnung des Dendritenbaumes in der Tangentialebene verhielten sich beide Gruppen gleich. Der Dendritenbaum von VIP-Zellen war in allen Schichten des Isokortex bis auf wenige Ausnahmen schmal. Unterschiede hingegen fanden sich in den laminären Bereichen, die von den Dendriten der Zellen aus beiden Gruppen erfasst wurden. VIP-Neurone in den supragranulären und der granulären Schichten wiesen sehr oft Dendriten auf, die bis in die Molekularschicht aufstiegen, sich dort aufzweigten und die bereits erwähnten perlenartigen Varikositäten ausbildeten (Abb. 13-15, 17). In der Tiefe erstreckten sich die Dendriten dieser Neurone bis in Schicht V hinein. Zellen aus dem oberen Teil der infragranulären Schichten, etwa der Schicht Va entsprechend, erreichten die Granulärschicht und endeten meist auch dort (Abb. 18, 19). VIP-Neurone aus dem Bereich unterhalb der Lamina Va hingegen erstreckten sich mit ihren Dendriten niemals bis in die Granulärschicht, sondern endeten entweder an der Schicht IV-V-Grenze oder darunter (Abb. 19, 20). Auch die Axone von VIP-Zellen in beiden Gruppen verhielten sich unterschiedlich. Die der ersten Gruppe zugehörigen Zellen, also Zellen in den Laminae II-Va, besaßen einen schmalen, vertikal orientierten Axonbaum mit einem mittleren Durchmesser von etwa 200 µm (Abb. 13-18). Nur sehr wenige dieser Zellen hatten ein Axon mit einer horizontalen Ausdehnung von mehr als 400 µm. Das Axon blieb in der horizontalen Ebene weitgehend beschränkt auf den von den Dendriten umfassten zylindrischen Gewebsabschnitt. Die weitaus meisten dieser Zellen hatten daher auch Axonbäume, deren horizontale Ausdehnung kleiner war als die Breite der Barrels. Entsprechend verblieben 85% der in den Schichten I-IV rekonstruierten Neurone entweder innerhalb einer Barrel-Kolumne oder außerhalb davon im Barrel-Septum oder dem Gewebe darüber oder darunter. Einige der rekonstruierten Zellen, die sich in der Peripherie einer Barrel-Kolumne befanden, wiesen eine markante Asymmetrie des Axonbaumes auf insofern, als sich das Axon von den seitlichen Barrel-Grenzen weg zum Zentrum des Barrels hin orientierte (Abb. 13, Zelle c). Andererseits gab es auch VIP-Zellen in den genannten Schichten, die diese Grenzen offensichtlich nicht respektierten (Abb. 15, Zelle b). Die Axone solcher Zellen erstreckten sich allerdings niemals über die unmittelbar benachbarte Barrel-Kolumne hinaus. Somit fielen die Zellen der ersten Gruppe, mit einer Lokalisation des Perikaryons innerhalb der Schichten I-Vb, auf durch die Tendenz, auf das Kompartiment, in dem sich das Perikaryon befand, beschränkt zu sein, also entweder auf eine Barrel-Kolumne oder auf den Septum-assoziierten Bereich zwischen den Barrel-Kolumnen. Unterschiede zwischen Zellen, die sich in den Barrels, und solchen, die sich in den Septa befanden, konnten mit Bezug auf ihre Zellfortsätze nicht beobachtet werden. Im Gegensatz dazu besaßen VIP-Zellen der zweiten Gruppe, deren Perikarya in den Schichten Vb und VI lagen, oft weit ausladende Axonbäume mit einem mittleren horizontalen Durchmesser von 550 µm (Abb. 19, 20). Eine der rekonstruierten Zellen wies sogar horizontale
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Axonkollateralen mit einer Länge von mehr als 800 µm auf, die sich über drei Barrel-Kolumnen erstreckten (Abb. 20, Zelle c). Eine besondere Orientierung der horizontalen äste mit Bezug auf Barrel-Reihen oder -Bögen, wie von intrinsischen Fasern des Barrel-Kortex bekannt [14], war aus dem vorliegenden Material nicht ersichtlich. Lediglich 46% der Neurone in dieser Gruppe blieben in der Ausdehnung ihrer Fortsätze auf den kolumnären Bereich beschränkt, innerhalb dessen das Soma der Zellen lag. 54% der Zellen hingegen überschritten die seitlichen Grenzen der Barrel-Kolumnen. Es ist an dieser Stelle zu betonen, dass Axone mit einem derart ausgedehnten horizontalen Verlauf nur in den Schichten Vb und VI angetroffen wurden, dass andererseits aber auch in diesen Schichten Zellen vorlagen, deren Axonbaum schmächtig und horizontal sehr begrenzt war. Die zahlenmäßige Verteilung von VIP-Neuronen mit unterschiedlichen Durchmessern des Axonbaumes auf die supragranulären, die granuläre sowie die zwei Abschnitte der infragranulären Schichten ist in Abbildung 12 zusammengefasst.
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![]() Abb. 14
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Kritische Beurteilung der angewandten Methodik Die in dieser Arbeit vorgestellten VIP-Neurone aus dem primär-somatosensorischen Kortex der Ratte wurden mit Hilfe von immunhistochemischen Methoden sichtbar gemacht und an einem Computermikroskop rekonstruiert. Die abgebildeten Zellrekonstruktionen zeigen, dass neben dem kompletten Dendritenbaum auch das Axon der VIP-Neurone hinreichend dargestellt wurde, um aufgrund dessen eine zuverlässige Klassifikation der Zellen zu gewährleisten. Trotzdem wird eine Schwäche dieses Versuchsprotokolls deutlich durch den Vergleich mit Neuronen aus dem frontalen Kortex der Ratte [43,71], die aufgrund elektrophysiologischer Merkmale identifiziert und mit Biocytin intrazellulär gefüllt und dargestellt worden sind. Rekonstruktionen solcher Zellen zeigen einen deutlich dichteren Axonbaum, der den Eindruck größerer Vollständigkeit erweckt (Abb. 21). Allerdings ist es kaum möglich, mit dieser aufwendigen Methode eine größere Anzahl von Zellen unselektiv darzustellen. Der für die vorliegende Arbeit angewandte immunhistochemische Ansatz hingegen stellt die weitaus meisten, wenn nicht alle in einem Schnitt enthaltenen VIP-Zellen dar und ist somit für einen umfassenden Bericht über VIP-Neurone in diesem Kortexabschnitt gut geeignet. Es bleibt allerdings anzumerken, dass auch beim immunhistochemischen Ansatz eine gewisse Selektion der darzustellenden Zellen insofern erfolgen muss, als es in der Praxis nicht möglich ist, alle angefärbten Zellen zu rekonstruieren. Um die VIP-Zellen innerhalb der geschilderten Grenzen möglichst vollständig rekonstruieren zu können, war es erforderlich, die Fortsetzungen von an der Schnittebene durchtrennten, bereits teilweise rekonstruierten Zellstrukturen im Folgeschnitt weiterzuverfolgen. Daher konnten aufeinander folgende Schnitte einer Serie nur immunhistochemisch und nicht mit der Nissl-Technik, die eine klare Differenzierung der kortikalen Schichten gestattet, angefärbt werden. Eine absolut genaue Abgrenzung der einzelnen Kortexschichten war deshalb bei dieser Untersuchung nicht möglich. Anhand der Darstellung der Barrels durch Cytochromoxidase-Histochemie konnte die Laminierung der Hirnrinde grob nachvollzogen werden. Allerdings ist fraglich, ob die Höhe der Barrels mit der Dicke der Schicht IV tatsächlich übereinstimmt. In der Literatur liegen Angaben vor, denen zufolge die durch Cytochromoxidase-Histochemie dargestellten Barrels auch Zellen aus den tieferen Bereichen der Schicht III umfassen [52]. Folglich ist die Dicke der Lamina IV innerhalb dieser Studie wahrscheinlich überschätzt worden, während die supragranulären Schichten als zu dünn eingeschätzt worden sind. Da aber keine wesentlichen Unterschiede zwischen Zellen in der Granulärschicht und den supragranulären Schichten deutlich geworden sind, bleibt die Feststellung der geschilderten Problematik für die vorliegende Studie ohne praktische Relevanz. Ein weiteres Problem stellt der Umstand dar, dass die VIP-Neurone für diese Studie von Koronarschnitten oder anderen, Koronarschnitten ähnlichen Hirnschnitten rekonstruiert worden sind, die die gesamte Dicke des Kortex erfassen. Theoretisch wären Tangentialschnitte durch den Barrel-Kortex, die das honigwabenähnliche Muster der Barrels wiedergeben, vermutlich besser geeignet gewesen, um das räumliche Verhältnis von VIP-Neuronen zu den Barrels in der Tangentialebene zu beurteilen. In der Praxis jedoch hat sich die hier geschilderte Schnitt-
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führung vor allem aus zwei Gründen bewährt. Zum einen wären wesentlich mehr Serienschnitte erforderlich gewesen, um einzelne Zellen zu rekonstruieren, da diese sich in vertikaler Richtung viel weiter erstrecken als in tangentialer Richtung. Je höher allerdings die Anzahl der für eine Zellrekonstruktion erforderlichen Serienschnitte ist, umso höher ist die Gefahr, dass das Gewebe bei der histologischen Aufbereitung Schaden nimmt und durch den Verlust eines Schnittes größere Abschnitte der Zelle nicht mehr rekonstruiert werden können. Zum anderen wäre die Schichtengliederung des Kortex schlechter beurteilbar gewesen. Bei der vorliegenden Schnittführung hingegen war sowohl die Lage der VIP-Neurone in der Tiefe des Kortex als auch das räumliche Verhältnis der Zellen zu wenigstens zwei Seiten der Barrels zuverlässig darstellbar.
Die Morphologie von VIP-Neuronen Die Population der VIP-Neurone im Barrel-Kortex bestand vorwiegend aus bipolaren und tripolaren, d.h. modifiziert bipolaren Zellen mit einer ausgeprägt vertikalen Orientierung der Dendriten. Die Dendriten der Zellen in den Schichten I-IV erstreckten sich meist bis zur Molekularschicht, während die Dendriten der Zellen in den infragranulären Schichten nicht bis zur Lamina II/III reichten. In dieser Hinsicht unterschieden sich die VIP-Neurone im primär-somatosensorischen Kortex von denen im frontalen Kortex der Ratte [71] (Abb. 21, Zelle a). Die von Morrison et al. [62] beschriebenen, typisch bipolaren Neurone mit zwei langen Dendriten, die in vertikaler Richtung weite Strecken unverzweigt überbrückten und sich erst weit distal endnah aufzweigten (Abb. 17, Zelle b), wurden im Verhältnis relativ selten angetroffen, dann vor allem in Lamina V und den supragranulären Schichten. Viele VIP-Zellen in den supragranulären Schichten, aber auch in Schicht IV, besaßen Axone, die in einer ähnlichen Weise in die darunter liegenden Schichten zogen, wie es von VIP-immunreaktiven Double-Bouquet-Zellen aus dem frontalen Kortex der Ratte bekannt ist [43] (Abb. 14, 21). Ausläufer solcher Axone zeigten in unterschiedlichen Schichten einen parallelen Verlauf zu den Dendriten anderer VIP-Neurone, denen sie sich auch über längere Strecken anlegten. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass die Aktivität von VIP-Zellen innerhalb der gleichen funktionellen Kolumne weitergeleitet wird, und ist kohärent zum schlanken Erscheinungsbild der Dendriten und Axone der Zellen in diesen Schichten. VIP-Zellen zeigten keine weitergehenden morphologischen Eigenschaften von Korbzellen (vergl. [33,42,47]). Es konnten zwar in unterschiedlichen Bereichen des Barrel-Kortex wiederholt perisomatische Anlagerungen von VIP-Axonkollateralen nebst Varikositäten im Sinne eines lockeren, korbartigen Geflechts um nicht angefärbte, VIP-negative Perikarya beobachtet werden (Abb. 8), wie sie auch schon im Frontalkortex der Ratte [44], dem visuellen Kortex der Katze [91] und dem prefrontalen Primatenkortex [34] beschrieben worden sind. Allerdings gelang es nicht, ausgehend von solchen perisomatischen Körben die beteiligten Axonkollateralen retrograd bis zum Axoninitialsegment zurückzuverfolgen. Die rekonstruierten VIP-Zellen bildeten nur gelegentlich einzelne Körbe aus, ohne dabei typische Eigenschaften von Korbzellen wie zum Beispiel ein multipolares Soma und insbesondere einen horizontal weiter ausgedehnten Axonbaum aufzuweisen [33,42,47]. Es ist daher anzunehmen, dass die beobachteten perisomatischen Anlagerungen von VIP-Varikositäten in den meisten Fällen eher der akzidentellen Annäherung von Axonen mehrerer VIP-Zellen en passant um das gleiche, nicht
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angefärbte Perikaryon entsprechen, ohne dass es sich dabei tatsächlich um Körbe von Korbzellen handelt.
Räumliches Verhältnis der Zellen zu den Barrels Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des räumlichen Verhältnisses von VIP-Zellen zu den Barrels. Im Vordergrund stand die Frage, inwieweit die Nähe der Barrels sich auf die Gestalt von VIP-Zellen auszuwirken scheint, eine Frage, die sich in ähnlicher, aber allgemeinerer Form schon anderen Autoren gestellt hat. Woolsey und Mitarbeiter [99] wiesen für 85% der auf Tangentialschnitten durch den Barrel-Kortex untersuchten Schicht-IV-Zellen eine Restriktion der Dendriten auf das Barrel nach, in dem sich das Soma der Zellen befand. Dabei wiesen sie auf Fälle hin, in denen sich die Dendriten von in der Peripherie eines Barrels gelegenen Neuronen auf auffällige Weise von der Barrel-Grenze weg zum Zentrum wandten, ohne die Grenze zu überschreiten. Barrel-Zellen in Mäusen, deren Vibrissenfollikel bei der Geburt lädiert worden waren, wiesen der Läsion entsprechende Anpassungen dieses Schemas auf [86]. Wenngleich Elston et al. [29] keine eindeutigen Hinweise für eine Restriktion der Dendriten von Schicht-IV-Zellen auf bestimmte Barrels fanden, erscheint es dennoch wahrscheinlich, dass diese in einem nicht näher zu beziffernden Ausmaß existiert. Darüber hinaus befanden Harris und Woolsey [40], dass eine Restriktion in genannter Weise auch für die Axone von Zellen innerhalb von Barrels zutrifft. In jüngerer Zeit war auf die ungleichmäßige Verteilung von GABA-immunreaktiven, inhibitorischen Interneuronen innerhalb des PMBSF der Maus hingewiesen worden [24], und auch VIP-immunreaktive Strukturen fanden sich spezifisch in der Peripherie von Mäuse-Barrels in größerer Zahl als im Barrel-Zentrum [104]. ähnliche Daten vom Barrel-Kortex der Ratte lagen in der Literatur bislang nicht vor. Die hier vorliegenden Einzelzellrekonstruktionen von VIP-Neuronen sind in ihrer Aussagekraft hinsichtlich der oben formulierten Fragestellung leider nicht eindeutig. VIP-Zellen in den Schichten I-Va sind gekennzeichnet durch ein in der Horizontalebene sehr schmales axonales und dendritisches Einzugsgebiet. Allein aufgrund dessen muss das VIP-Neuron in den meisten Fällen auf das entsprechende Kompartiment innerhalb oder außerhalb einer Barrel-Kolumne beschränkt bleiben. Innerhalb dieser Schichten stellt die Lokalisation des Perikaryons somit einen guten Indikator für den Einzugsbereich der Zellfortsätze dar. Eine Asymmetrie der Dendriten aufgrund der Nähe zu den Barrel-Grenzen in der im obigen Absatz geschilderten Weise konnte nicht nachgewiesen werden. Dazu waren die Dendriten zu streng vertikal orientiert und verzweigten sich zu selten. Gelegentlich fielen allerdings Asymmetrien des Axonbaumes bei Zellen auf, die sich in der Nähe der vertikalen Grenzen einer Barrel-Kolumne befanden, und deren Axonkollateralen sich von dieser Grenze weg orientierten (Abb. 13, Zelle c). Nichtsdestoweniger wiesen 15% der in den Schichten I-Va rekonstruierten Zellen ein Axon auf, dessen äste sich auf unspezifische Weise sowohl innerhalb einer Barrel-Kolumne als auch in den Septum-assoziierten Bereichen verzweigten. Für die Schichten I-Va geltend lässt sich daher eine Tendenz von VIP-Neuronen feststellen, sich innerhalb der Kolumne, in der sich das Perikaryon befindet, aufzuzweigen und auch zu verbleiben. Ob dieses Muster allerdings kausal auf das Vorhandensein von Barrels in diesem Kortexabschnitt zurückzuführen ist, wird sich auf diese Weise nicht abschließend beantworten lassen. Aufschluss darüber kann man sich von einer vergleichenden Untersuchung der VIP-Neurone in Ratten
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mit experimentell alteriertem Barrel-Feld oder vielleicht auch in der Mausmutante "Barrelless" [94], bei der keine Barrels ausgebildet werden, erhoffen. Während für VIP-Neurone in den Schichten I-Va eine relative Beschränktheit auf eines der zwei Hauptkompartimente im Barrel-Kortex bestätigt werden kann, ist das Gegenteil der Fall für die Zellen in den darunterliegenden Schichten. Wenngleich die Ausdehnung von Soma und Dendritenbaum nicht wesentlich unterschiedlich ist von den darüberliegenden Zellen, ist der Axonbaum hier gekennzeichnet durch zum Teil weitreichende horizontale Axonkollateralen. Aufgrund dieses Merkmals überschreitet mehr als die Hälfte dieser Zellen mit ihrem Axon die seitlichen Grenzen einer Barrel-Kolumne. Es stellt sich die Frage nach dem Grund für diesen auffälligen, schichtengebundenen Unterschied zwischen VIP-Neuronen der einen und der anderen Gruppe, und mindestens zwei mögliche Antworten bieten sich an. Ein erster möglicher Grund kann darin bestehen, dass die Population von VIP-immunreaktiven Zellen an sich nicht homogen ist, sondern sich in mehrere Subpopulationen mit unterschiedlichen Merkmalen und Funktionen weiter aufteilen lässt. Für eine solche Heterogenität lassen sich neben den genannten morphologischen Differenzen auch 1.) Unterschiede hinsichtlich der Synthese von Neurotransmittern und Kalzium-bindenden Proteinen sowie 2.) unterschiedliche elektrophysiologische Verhaltensweisen der Zellen anführen:
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Der Hypothese einer an sich bestehenden Heterogenität der VIP-Zellpopulation mit einer Beteiligung der Zellmorphe steht ein weiterer Erklärungsansatz entgegen. Zahlreiche Publikationen wiesen auf Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften der isokortikalen Schichten und der in ihnen enthaltenen Neurone hin. Aus dem kontralateralen Vibrissenfeld kommende, in den Kerngebieten des Nervus trigeminus und des Thalamus umgeschaltete, spezifische thalamokortikale Afferenzen enden im Barrel-Kortex überwiegend in somatotoper Ordnung in den Barrels in Schicht IV, in geringer geordneter Weise auch an der Grenze der Schichten V und VI [2,84,85,94]. Ausgehend von der Granulärschicht breitet sich die auf die Reizung einer bestimmten Vibrisse folgende Erregung zunächst in die supragranulären Schichten und dann in die infragranulären Schichten aus [7,83,90,95]. Auch eine unmittelbare Erregungsleitung aus der Granulärschicht in die infragranulären Schichten existiert [90] und macht sich durch vergleichsweise geringe Latenzen der dortigen Neuronen auf somatosensorische Stimuli bemerkbar [16]. Inwieweit die die Schicht IV durchziehenden apikalen Dendriten der untersuchten Zellen sowie die Terminalen von thalamokortikalen Axonen an der Schicht-V/VI-Grenze zu diesen Latenzen beitragen, muss an dieser Stelle aufgrund fehlender Daten offen gelassen werden. Auf ihrem Weg werden die zunächst einfachen, spezifischen Informationen modifiziert und mit Informationen von benachbarten Vibrissen und aus anderen Bereichen des ZNS integriert. Dies lässt sich zum einen durch physiologische Untersuchungen [19,77], zum anderen durch anatomische Darstellungen der intrakortikalen Faserverbindungen in den einzelnen Schichten [14,32,49,82,90,101] erkennen. Letztere haben wiederholt die im Verhältnis geringe Ausbildung von horizontalen Fasern innerhalb der Granulärschicht aufgezeigt [14,82]. Für die übrigen Schichten wurde eine ausgeprägte Interkonnektivität zwischen mehreren Barrel-Kolumnen, insbesondere zwischen solchen der gleichen Barrel-Reihe (Abb. 1), aufgezeigt [14]. Die Neurone der Granulärschicht weisen daher die kleinsten rezeptiven Felder auf. In den supragranulären Schichten sind die rezeptiven Felder der Neurone bereits größer, am größten sind sie schließlich in den infragranulären Schichten, wo einzelne Zellen auf den Ausschlag von wesentlich mehr Vibrissen reagieren als nur auf die Reizung derjenigen Vibrisse, die dem entsprechenden Barrel primär zugeordnet ist [6,19,77,78,95]. Der Informationsfluss in die infragranulären Schichten ist sowohl konvergenter als auch divergenter als der Informationsfluss in die supragranulären Schichten und die Granulärschicht [6,19,77]. Als Folge hat die Reizung einer einzelnen Vibrisse Auswirkungen auf Neurone in einem wesentlich breiteren Abschnitt in den infragranulären Schichten als in den supragranulären Schichten und der Granulärschicht. Es stellt sich die Frage, ob den Parallelen zwischen der Breite des Axonbaumes von VIP-Zellen und der Breite der rezeptiven Felder in den infragranulären Schichten des Barrel-Kortex eine direkte Kausalität zugrunde liegt.
Die Funktion von VIP-Neuronen im Barrel-Kortex Angesichts der vertikalen Ausdehnung und Orientierung ihrer Dendriten darf vermutet werden, dass VIP-Neurone eine bislang nur unvollständig untersuchte Fülle von unterschiedlichen Afferenzen in mehreren kortikalen Schichten erhalten und integrieren. Es ist bekannt, dass VIP-Neurone direkte thalamokortikale Afferenzen in den Barrels erhalten [84]. Die hier vorgestellten dendritischen Verzweigungsmuster legen nahe, dass vor allem VIP-Neurone, deren Somata in den supragranulären Schichten und der Granulärschicht liegen, Ziel dieser
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thalamokortikalen Afferenzen sind. Viele dieser Neurone erreichen außerdem die Molekularschicht mit ihren Dendriten, die sich dort in auffälliger Weise verzweigen. Wenngleich noch nicht untersucht, ist es dennoch wahrscheinlich, dass diese Dendritenzweige in Schicht I von Fasern aus anderen neokortikalen Arealen afferentiert werden. Zumindest ist bekannt, dass die Molekularschicht von exzitatorischen Axonen aus dem ipsilateralen primär-motorischen und sekundär-somatosensorischen Kortex wie auch dem kontralateralen Parietalkortex [18] und aus den unspezifischen Thalamuskernen [56] durchsetzt wird. Welche Fasern im Einzelnen Kontakte mit VIP-Neuronen bilden, liegt allerdings im Dunkeln. Darüberhinaus sind Afferenzen von lokalen Pyramidenzellen auf VIP-Zellen im Frontalkortex der Ratte elektrophysiologisch nachgewiesen [71] und auch morphologisch dargestellt worden (Staiger, unveröffentlichte Beobachtung), zumindest in den supragranulären Schichten. Neben den exzitatorischen Afferenzen sind auch inhibitorische Kontakte auf VIP-Zellen in der Literatur beschrieben. So werden diese Neurone im Rattenkortex ausgiebig von Parvalbumin bildenden Korbzellen innerviert [81]. Parvalbumin-immunreaktive Neurone bilden eine wichtige Klasse von GABAergen, inhibitorischen Interneuronen und besitzen typische morphologische Eigenschaften von Korb- und Chandelier-Zellen [8,17,44]. Auch sie erhalten wie VIP-Neurone direkte, monosynaptische Afferenzen aus dem Nucleus ventralis posteromedialis thalami [85,87]; tatsächlich scheinen sie innerhalb der Gruppe der inhibitorischen Interneurone das Hauptziel der spezifischen thalamokortikalen Afferenzen darzustellen [85]. Im Gegensatz zu den VIP-Neuronen der Schichten I-Va bilden Korbzellen allerdings einen in der Horizontalebene weit ausladenden Axonplexus und sind daher möglicherweise die Grundlage für die laterale Inhibition im Barrel-Kortex, einem wichtigen Baustein in der Datenverarbeitung somatosensorischer Stimuli. Neben dem hemmenden Einfluss von Parvalbumin produzierenden Neuronen unterliegen VIP-Neurone außerdem vermutlich auch der Inhibition durch andere VIP-Zellen innerhalb des Kortex. So konnten im Laufe dieser Arbeit wiederholt einzelne VIP-immunreaktive Boutons in unmittelbarer Nähe von Dendriten und Somata anderer immungefärbter VIP-Zellen beobachtet werden. Unter anderem lagern sich VIP-immunreaktive Axone über längere Strecken an die Dendriten anderer VIP-Zellen an und bilden dabei axodendritische Bündel mit einer mutmaßlich höheren Anzahl von Synapsen ([80], eigene Beobachtung). Vermutlich werden die VIP-Zellen in den infragranulären Schichten über solche Kontakte in Lamina V von VIP-Neuronen der darüberliegenden Schichten innerviert. Somit scheinen zahlreiche unterschiedliche Afferenzen sowohl exzitatorischer als auch inhibitorischer Natur auf den VIP-Neuronen zusammenzulaufen. Die Zellen erhalten dadurch vermutlich einen umfassenden Eindruck vom Zustand der neuronalen Aktivität in dem entsprechenden lokalen, der Form des Dendritenbaumes entsprechend säulenartigen Kortexabschnitt. Angesichts der den VIP-Neuronen zugedachten Funktionen (siehe Einleitung) erscheint dies sehr zweckmäßig. Unterschiedliche Reaktionen von VIP-Neuronen auf die eingehenden Informationen kommen in Betracht und sollen im Folgenden theoretisch erörtert werden. Bezogen auf die Schichten I-IV einer Barrel-Kolumne soll, vereinfachend, die vom Nucleus ventralis posteromedialis thalami ausgehende Exzitation in Folge eines Vibrissenausschlags die wesentliche Quelle der Erregung sein. Diese Erregung breitet sich innerhalb der Barrel-Kolumne aus, erreicht aber auch schon zu einem frühen Zeitpunkt die direkt thalamokortikal afferentierten VIP-Neurone. Innerhalb einer bestimmten Kolumne werden die VIP-Neurone neben der thalamo-kortikalen Afferenz außerdem über ihre Dendriten durch Afferen-
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zen in Schicht I erregt. Gegensätzlich dazu erhalten sie bei Erregung der benachbarten Barrel-Kolumne von den dort lokalisierten Korbzellen hemmende Einflüsse, die die erregenden Einflüsse aus der eigenen Kolumne abschwächen. Ferner wird die Aktivität der VIP-Zellen auch noch durch noradrenerge Fasern aus dem Locus coeruleus beeinflusst [67] (Abb. 22). Je nach Summe der exzitatorischen und inhibitorischen Einflüsse innerhalb des lokalen, meist auf eine Barrel-Kolumne beschränkten Kortexabschnitts setzen die Neurone unterschiedliche Mengen von VIP, GABA, Acetylcholin und anderen Stoffen im umliegenden Gewebe frei, bei starker Erregung mehr, bei schwacher Erregung weniger. GABA bewirkt eine Zügelung der Exzitation von benachbarten Neuronen. VIP stimuliert innerhalb des betroffenen Gewebes die Glykogenolyse, so dass im Falle einer erhöhten Aktivität rechtzeitig Substrate des Energiestoffwechsels bereitstehen. Acetylcholin und VIP stellen die lokalen Blutgefäße weit und gewährleisten dadurch eine angemessene Versorgung des Gewebes. Ferner modifizieren sie die neuronale Reaktion der umliegenden Zellen auf die Erregung der entsprechenden Barrel-Kolumne. Die Hauptaufgabe der VIP-Zellen innerhalb des kolumnären Zellgefüges wäre somit die frühzeitige Anpassung der Erregung innerhalb des entsprechenden Gewebeabschnittes und die Feineinstellung und Gewährleistung des Zellstoffwechsels, um diese Erregung zu unterhalten. Vom morphologischen Aspekt her erscheinen die weeping-willow-artigen Zellen in Schicht IV des Barrel-Kortex denkbar geeignet, dieser Aufgabe nachzukommen. über ihre Dendriten erhalten sie vermutlich direkte thalamokortikale Afferenzen, und über ihr Axon können sie das darüberliegende supragranuläre Gewebe beeinflussen, auf das sich die Exzitation im Rahmen der geschilderten Erregungsfortleitung innerhalb einer Barrel-Kolumne als nächstes fortpflanzen würde. Während sich ein solches Szenario in geschilderter Weise allerdings für die VIP-Zellen in den granulären und supragranulären Schichten entwickeln lässt, erscheint dies schwieriger für die VIP-Neurone in den infragranulären Schichten. Im Prinzip sollten sich die VIP-Zellen dort aber nicht wesentlich anders verhalten, und auch ihre Aufgabe soll in der Feineinstellung der Erregung und der Stoffwechselanpassung der Zellen im lokalen Gewebe bestehen, wenngleich die Schaltkreise der Erregung innerhalb der infragranulären Schichten nicht so einfach herzuleiten sind. Unter diesem Aspekt ist die im Rahmen dieser Arbeit aufgezeigte schichtenabhängige Assoziation von VIP-Zell-Axonen zu den barrel-bezogenen Kompartimenten einleuchtend erklärbar. Die relativ strikte Assoziation in den Schichten I-Va ist angesichts der noch relativ gut erhaltenen Spezifität der verarbeiteten Informationen hinsichtlich des jeweils zugeordneten Tasthaares zweckmäßig. In den Schichten Vb und VI hingegen ist diese Assoziation weitgehend aufgehoben infolge einer ausgeprägten horizontalen Kollateralisation. Insofern sind je nach der betrachteten isokortikalen Schicht mehr oder weniger Zellen in einem eher schmalen oder breiten Kortexabschnitt vom Einfluss einzelner VIP-Zellen betroffen. Es ergibt sich, dass eine einzelne VIP-Zelle in den infragranulären Schichten die Stoffwechselregulation innerhalb eines mehrere Barrel-Kolumnen umfassenden Gewebeausschnittes übernehmen kann. Dies steht in Einklang zur integrativen Funktion der infragranulären Schichten [6,77], deren Nervenzellen sich durch große, aber schwach ausgebildete rezeptive Felder auszeichnen und auf die Stimulation von mehr Vibrissen reagieren als die Neurone der darüberliegenden Schichten [6]. Demzufolge ist der in die infragranulären Schichten gerichtete Informationsfluss divergenter als in den oberen Schichten. Es erscheint daher sinnvoll, dass die entsprechenden lokalen VIP-Zellen die Anpassung des Gewebes an die auf einen spezifischen Reiz folgenden unterschiedlichen Erregungszustände in einem entsprechend ausgedehnteren Bereich durchführen müssen. Dieser Aufgabe werden sie durch ihren horizontal weiter kollateralisierenden Axonbaum gerecht.
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Vasoaktivem Intestinalem Polypeptid (VIP) im Kortex der Ratte kommt mutmaßlich eine besondere Funktion in der Steuerung und Förderung von Stoffwechselvorgängen und der neuronalen Aktivität von Nervenzellen zu. Es wird überwiegend in bipolaren, senkrecht zur pialen Oberfläche orientierten, GABA und teilweise auch Cholin-Acetyltransferase enthaltenden Interneuronen exprimiert. Aufgrund ihrer schlanken somatodendritischen Gestalt sind diese Zellen mit isokortikalen kolumnären Organisationsmustern in Verbindung gebracht worden, die mit den Barrels des primär-somatosensorischen Kortex der Ratte ein morphologisches Korrelat besitzen. Um eine Assoziation von VIP-Zellen und Barrels aufzuzeigen, wurde die immunhistochemische Darstellung von VIP in seinen Ursprungszellen und die Darstellung von Barrels durch das Sichtbarmachen ihrer Cytochromoxidase-Aktivität auf histologischen Schnitten durch die Tiefe des primär-somatosensorischen Kortex kombiniert. VIP-Neurone fanden sich in den supragranulären (48% aller VIP-Neurone) und infragranulären Schichten (36%) sowie in den Barrels und den Septa der Granulärschicht (16%). Einzelne Zellen fanden sich auch in der weißen Substanz. Innerhalb der Granulärschicht wurden mehr VIP-Neurone in den Septen zwischen den Barrels als in den Barrels gefunden. Dieser Trend schlug sich in einer Zelldichte nieder, die innerhalb der Barrels um ein Drittel niedriger war als in den Septa. Zur genauen Untersuchung ihrer Gestalt wurden VIP-Zellen aus den unterschiedlichen Schichten mit einem Computermikroskop und der Neurolucida-Software über zusammenhängende Serienschnitte dreidimensional rekonstruiert. Die rekonstruierten Nervenzellen wiesen überwiegend typische Eigenschaften von bipolaren, einfach oder zweifach gebüschelten Neuronen auf. Hinsichtlich der Gestalt des Axons fanden sich schichtenspezifische Unterschiede zwischen 1.) VIP-Neuronen in den supragranulären Schichten, der Granulärschicht und dem oberen Abschnitt der infragranulären Schichten, etwa entsprechend Schicht Va, einerseits und 2.) den VIP-Neuronen im unteren Abschnitt der infragranulären Schichten andererseits. Erstere besaßen Dendriten, die oft bis in die Schicht I hineinragten und sich dort mehrfach dichotom verzweigten, sowie vertikal orientierte Axonbäume, deren tangentialer Durchmesser stets deutlich geringer war als die Breite einer Barrel-Kolumne. Daher blieben sowohl der Dendriten- als auch der Axonbaum dieser Zellen meist auf die Kolumne, in der sich das Soma der Neurone befand, beschränkt. Die VIP-Neurone der zweiten Gruppe hingegen waren gekennzeichnet durch Dendriten, die nicht über die Schicht-IV-V-Grenze hinausreichten, und Axone mit oft langen horizontalen Kollateralen, die sich über zwei oder mehr Barrel-Kolumnen erstreckten. Die genannten Gruppen von VIP-Zellen werden diskutiert als mögliche Anpassung an die unterschiedlichen Formen der Informationsverarbeitung in den entsprechenden Schichten. So modulieren die VIP-Neurone den Gewebestoffwechsel einmal in einer spezifisch afferentierten, umschriebenen Region in den oberen Schichten des Kortex und in einer eher extensiv afferentierten, integrativ arbeitenden, breiteren Region in den unteren Schichten.
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Mein Dank gilt Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Zilles für seine wertvollen Anregungen und seine Diskussionsbereitschaft und seine wohlwollende Unterstützung in allen wissenschaftlichen Fragen. Seiner Erfahrung und seinem Scharfsinn gebührt mein ganzer Respekt. Ferner danke ich Herrn Dr. med. Jochen Staiger, der mich als den ersten von ihm betreuten Doktoranden mit allem erdenklichen Idealismus betreut und beraten und diese Arbeit erst ermöglicht hat. Für seine Freundlichkeit, seine Freundschaftlichkeit und sein jederzeit offenes Ohr danke ich ihm von Herzen. Einen besonderen Dank zolle ich Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Egbert Welker, der mir meinen Aufenthalt in Lausanne ermöglicht, mich betreut und mir meine Augen für alle erdenklichen wissenschaftlichen und menschlichen Fragen geöffnet hat. Herrn Dr. Rudolf Kraftsik danke ich für seine freundliche Einarbeitung in das Neurolucida-System und für seinen Rat bei statistischen Fragestellungen. Herrn Dr.-Ing. Schleicher danke ich für seine Unterstützung bei der statistischen Auswertung der vorliegenden Ergebnisse. Herrn Dr. Laurent Tettoni danke ich für die freundliche Einweisung in die beeindruckende, von ihm mitentwickelte Software Maxsim. Herrn Dr. Tamas Görcs danke ich für die freundliche Bereitstellung des VIP-Antikörpers. Frau Opfermann-Rüngeler danke ich für ihre Beratung bei der Erstellung meines Posters für Berlin. Diese Arbeit wurde mit der wertvollen Unterstützung der European Science Foundation im Rahmen des European Neuroscience Program durchgeführt. Ich bedanke mich von Herzen bei allen Menschen, deren Hilfe mir im Rahmen dieses Stipendiums zuteil geworden ist. Der Neurowissenschaftlichen Gesellschaft danke ich für die großzügige Vergabe eines Reisestipendiums zur Teilnahme am Treffen der European Neuroscience Association in Berlin (27.06. - 01.07. 1998).
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[1] Acsády, L., Arabadzisz, D. und Freund, T.F. Correlated morphological and neurochemical features identify different subsets of VIP-immunoreactive interneurons in rat hippocampus, Neuroscience, 73 (1996) 299-315. [2] Agmon, A. und Connors, B.W. Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro, Neuroscience, 41 (1991) 365-379. [3] Antonopoulos, J., Papadopoulos, G.C., Karamanlidis, A.N., Parnavelas, J.G., Dinopoulos, A. und Michaloudi, H. VIP- and CCK-like-immunoreactive neurons in the hedgehog (Erinaceus europaeus) and sheep (Ovis aries) brain, J. Comp. Neurol. 263 (1987) 290-307. [4] Armstrong-James, M. The nature and plasticity of sensory processing within adult rat barrel cortex. In E.G. Jones und I.T. Diamond (Hg.) The barrel cortex of rodents, Plenum Press, New York, 1995, S. 333-373. [5] Armstrong-James, M., Callahan, C.A. und Friedman, M.A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex, J. Comp. Neurol. 303 (1991) 193-210. [6] Armstrong-James, M. und Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat S1 "barrel" cortex, J. Comp. Neurol. 263 (1987) 265-281. [7] Armstrong-James, M., Fox, K. und Das-Gupta, A. Flow of excitation within rat barrel cortex on striking a single vibrissa, J. Neurophysiol. 68 (1992) 1345-1358. [8] Baimbridge, K.G., Celio, M.R. und Rogers, J.H. Calcium-binding proteins in the nervous system, Trends Neurosci. 15 (1992) 303-308. [9] Bates, C.A. und Killackey, H.P. The organization of the neonatal rat's brainstem trigeminal complex and its role in the formation of central trigeminal patterns, J. Comp. Neurol. 240 (1985) 265-287. [10] Bayraktar, T., Staiger, J.F., Acsady, L., Cozzari, C., Freund, T.F. und Zilles, K. Co-localization of vasoactive intestinal polypeptide, gamma-aminobutyric acid and choline acetyltransferase in neocortical interneurons of the adult rat, Brain Res. 757 (1997) 209-217. [11] Bayraktar, T., Staiger, J.F., Welker, E., Freund, T.F. und Zilles, K. Relationship of interneurons immunoreactive for vasoactive intestinal polypeptide to barrels in the adult rat primary somatosensory cortex, Eur. J. Neurosci. 10, Suppl. 10 (1998) 138 (Abstract) [12] Bayraktar, T., Welker, E., Freund, T.F., Zilles, K. und Staiger, J.F. Neurons immunoreactive for Vasoactive Intestinal Polypeptide in the rat primary somatosensory cortex: Morphology and spatial relationship to barrel-related columns. J. Comp. Neurol. 420 (2000) 291-304.
|
[13] Benagiano, V., Virgintino, D., Maiorano, E., Rizzi, A., Palombo, S., Roncali, L. und Ambrosi, G. VIP-like immunoreactivity within neurons and perivascular neuronal processes of the human cerebral cortex, Europ. J. Histochem. 40 (1996) 53-56. [14] Bernardo, K.L., McCasland, J.S., Woolsey, T.A. und Strominger, R.N. Local intra- and interlaminar connections in mouse barrel cortex, J. Comp. Neurol. 291 (1990) 231-255. [15] Brenneman, D.E. und Eiden, L.E. Vasoactive intestinal peptide and electrical activity influence neuronal survival, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (1986) 1159-1162. [16] Brumberg, J.C., Pinto, D.J. und Simons, D.J. Cortical columnar processing in the rat whisker-to-barrel system, J. Neurophysiol. 82 (1999) 1808-1817. [17] Cauli, B., Audinat, E., Lambolez, B., Angulo, M.C., Ropert, N., Tsuzuki, K., Hestrin, S. und Rossier, J. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells, J. Neurosci. 17 (1997) 3894-3906. [18] Cauller, L.J., Clancy, B. und Connors, B.W. Backward cortical projections to primary somatosensory cortex in rats extend long horizontal axons in layer I, J. Comp. Neurol. 390 (1998) 297-310. [19] Chapin, J.K. Laminar differences in sizes, shapes, and response profiles of cutaneous receptive fields in the rat SI cortex, Exp. Brain Res. 62 (1986) 549-559. [20] Chédotal, A., Cozzari, C., Faure, M.-P., Hartman, B.K. und Hamel, E. Distinct choline acetyltransferase (ChAT) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) bipolar neurons project to local blood vessels in the rat cerebral cortex, Brain Res. 646 (1994) 181-193. [21] Chédotal, A., Umbriaco, D., Descarries, L., Hartman, B.K. und Hamel, E. Light and electron microscopic immunocytochemical analysis of the neurovascular relationships of choline acetyltransferase and vasoactive intestinal polypeptide nerve terminals in the rat cerebral cortex, J. Comp. Neurol. 343 (1994) 57-71. [22] Chiaia, N.L., Rhoades, R.W., Bennett-Clarke, C.A., Fish, S.E. und Killackey, H.P. Thalamic processing of vibrissal information in the rat. I. Afferent input to the medial ventral posterior and posterior nuclei, J. Comp. Neurol. 314 (1991) 201-216. [23] Chiaia, N.L., Rhoades, R.W., Fish, S.E. und Killackey, H.P. Thalamic processing of vibrissal information in the rat: II. Morphological and functional properties of medial ventral posterior nucleus and posterior nucleus neurons, J. Comp. Neurol. 314 (1991) 217-236. [24] Chmielowska, J., Stewart, M.G. und Bourne, R.C. g-Aminobutyric acid (GABA) immunoreactivity in mouse and rat first somatosensory (SI) cortex: description and comparison, Brain Res. 439 (1988) 155-168. [25] Connor, J.R. und Peters, A. Vasoactive intestinal polypeptide-immunoreactive neurons in rat visual cortex, Neuroscience, 12 (1984) 1027-1044.
|
[26] Cox, S.B., Woolsey, T.A. und Rovainen, C.M. Localized dynamic changes in cortical blood flow with whisker stimulation corresponds to matched vascular and neuronal architecture of rat barrels, J. Cereb. Blood Flow Metab. 13 (1993) 899-913. [27] Dauphin, F., Lacombe, P., Sercombe, R., Hamel, E. und Seylaz, J. Hypercapnia and stimulation of the substantia innominata increase rat frontal cortical blood flow by different cholinergic mechanisms, Brain Res. 553 (1991) 75-83. [28] Eckenstein, F. und Baughman, R.W. Two types of cholinergic innervation in cortex, one co-localized with vasoactive intestinal polypeptide, Nature, 309 (1984) 153-155. [29] Elston, G.N., Pow, D.V. und Calford, M.B. Neuronal composition and morphology in layer IV of two vibrissal barrel subfields of rat cortex, Cereb. Cortex, 7 (1997) 422-431. [30] Emson, P.C., Fahrenkrug, J. und Spokes, E.G.S. Vasoactive intestinal polypeptide (VIP): distribution in normal human brain and in Huntington's disease, Brain Res. 173 (1979) 174-178. [31] Erzurumlu, R.S., Bates, C.A. und Killackey, H.P. Differential organization of thalamic projection cells in the brain stem trigeminal complex of the rat, Brain Res. 198 (1980) 427-433. [32] Fabri, M. und Burton, H. Ipsilateral cortical connections of primary somatic sensory cortex in rats, J. Comp. Neurol. 311 (1991) 405-424. [33] Fairén, A., DeFelipe, J. und Regidor, J. Nonpyramidal neurons - general account. In A. Peters und E.G. Jones (Hg.) Cellular components of the cerebral cortex, Plenum Press, New York und London, 1984, S. 201-253. [34] Gabbott, P.L.A. und Bacon, S.J. Vasoactive intestinal polypeptide containing neurons in monkey medial prefrontal cortex (mPFC): colocalization with calretinin, Brain Res. 744 (1997) 179-184. [35] Glaser, J.R. und Glaser, E.M. Neuron imaging with Neurolucida - A PC-based system for image combining microscopy, Comput. Med. Imag. Graphics, 14 (1990) 307-317. [36] Gozes, I., McCune, S.K., Jacobson, L., Warren, D., Moody, T.W., Fridkin, M. und Brenneman, D.E. An antagonist to vasoactive intestinal peptide affects cellular functions in the central nervous system, J. Pharmacol. Exp. Ther. 257 (1991) 959-966. [37] Gressens, P., Marret, S., Hill, J.M., Brenneman, D.E., Gozes, I. und Fridkin, M. Vasoactive intestinal peptide prevents excitotoxic cell death in the murine developing brain, J. Clinic. Invest. 100 (1997) 390-397. [38] Gulyás, A.I., Görcs, T.J. und Freund, T.F. Innervation of different peptide-containing neurons in the hippocampus by GABAergic septal afferents, Neuroscience, 37 (1990) 31-44.
|
[39] Hajós, F., Zilles, K., Gallatz, K., Schleicher, A., Kaplan, I. und Werner, L. Ramification patterns of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-cells in the rat primary visual cortex, Anat. Embryol. 178 (1988) 197-206. [40] Harris, R.M. und Woolsey, T.A. Computer-assisted analysis of barrel neuron axons and their putative synaptic contacts, J. Comp. Neurol. 220 (1983) 63-79. [41] Heistad, D.D., Marcus, M.L., Said, S.I. und Gross, P.M. Effect of acetylcholine and vasoactive intestinal peptide on cerebral blood flow, Am. J. Physiol. 239 (1980) 73-80. [42] Jones, E.G. und Hendry, S.H.C. Basket cells. In A. Peters und E.G. Jones (Hg.) Cellular components of the cerebral cortex, Plenum Press, New York und London, 1984, S. 309-336. [43] Kawaguchi, Y. und Kubota, Y. Physiological and morphological identification of somatostatin- or vasoactive intestinal polypeptide-containing cells among GABAergic cell subtypes in rat frontal cortex, J. Neurosci. 16 (1996) 2701-2715. [44] Kawaguchi, Y. und Kubota, Y. GABAergic cell subtypes and their synaptic connections in rat frontal cortex, Cereb. Cortex, 7 (1997) 476-486. [45] Killackey, H.P. The somatosensory cortex of the rodent, Trends Neurosci. 6 (1983) 425-429. [46] Kim, U. und Ebner, F.F. Barrels and Septa: Separate circuits in rat barrel field cortex, J. Comp. Neurol. 408 (1999) 489-505. [47] Kisvárday, Z.F., Martin, K.A.C., Whitteridge, D. und Somogyi, P. Synaptic connections of intracellularly filled clutch cells: a type of small basket cell in the visual cortex of the cat, J. Comp. Neurol. 241 (1985) 111-137. [48] Koralek, K.-A., Jensen, K.F. und Killackey, H.P. Evidence for two complementary patterns of thalamic input to the rat somatosensory cortex, Brain Res. 463 (1988) 346-351. [49] Koralek, K.-A., Olavarria, J. und Killackey, H.P. Areal and laminar organization of corticocortical projections in the rat somatosensory cortex, J. Comp. Neurol. 299 (1990) 133-150. [50] Kubota, Y., Hattori, R. und Yui, Y. Three distinct subpopulations of GABAergic neurons in rat frontal agranular cortex, Brain Res. 649 (1994) 159-173. [51] Land, P.W., Buffer, S.A. und Yaskosky, J.D. Barreloids in adult rat thalamus: Three-dimensional architecture and relationship to somatosensory cortical barrels, J. Comp. Neurol. 355 (1995) 573-588. [52] Land, P.W. und Simons, D.J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex, J. Comp. Neurol. 238 (1985) 225-235. [53] Lindh, B. und Hökfelt, T. Structural and functional aspects of acetylcholine peptide coexistence in the autonomic nervous system, Prog. Brain Res. 84 (1990) 175-191.
|
[54] Lorente de Nó, R. The cerebral cortex: architecture, intracortical connections and motor projections. In J.F. Fulton (Hg.) Physiology of the Nervous System, Oxford University Press, 1938, S. 291-339. [55] Lorén, I., Emson, P.C., Fahrenkrug, J., Björklund, A., Alumets, J., Hakanson, R. und Sundler, F. Distribution of vasoactive intestinal polypeptide in the rat and mouse brain, Neuroscience, 4 (1979) 1953-1976. [56] Lu, S.-M. und Lin, R.C.-S. Thalamic afferents of the rat barrel cortex: A light- and electron-microscopic study using Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin as an anterograde tracer, Somatosens. Motor Res. 10 (1993) 1-16. [57] Magistretti, P.J. und Morrison, J.H. Noradrenaline- and vasoactive intestinal peptide-containing neuronal systems: functional convergence with contrasting morphology, Neuroscience, 24 (1988) 367-378. [58] Magistretti, P.J. und Schorderet, M. VIP and noradrenaline act synergistically to increase cyclic AMP in cerebral cortex, Nature, 308 (1984) 280-282. [59] Martin, J.-L. und Magistretti, P.J. Pharmacological studies of voltage-sensitive Ca2+-channels involved in the release of Vasoactive Intestinal Peptide evoked by K+ in mouse cerebral cortical slices, Neuroscience, 30 (1989) 423-431. [60] Martin, J.L., Feinstein, D.L., Yu, N., Sorg, O., Rossier, C. und Magistretti, P.J. VIP receptor subtypes in mouse cerebral cortex: evidence for a differential localization in astrocytes, microvessels and synaptosomal membranes, Brain Res. 587 (1992) 1-12. [61] McCulloch, J. und Edvinsson, L. Cerebral circulatory and metabolic effects of vasoactive intestinal polypeptide, Am. J. Physiol. 238 (1980) H449-H456. [62] Morrison, J.H., Magistretti, P.J., Benoit, R. und Bloom, F.E. The distribution and morphological characteristics of the intracortical VIP-positive cell: an immunohistochemical analysis, Brain Res. 292 (1984) 269-282. [63] Mountcastle, V.B. Central nervous mechanisms in mechanoreceptive sensibility. In I. Darian-Smith (Hg.) Section 1: The Nervous System, Vol. III; Sensory Processes, Part 2, Bethesda, Maryland, 1984, S. 789-878. [64] Murphy, P.C., Grieve, K.L. und Sillito, A.M. Effects of vasoactive intestinal polypeptide on the response properties of cells in area 17 of the cat visual cortex, J. Neurophysiol. 69 (1993) 1465-1474. [65] Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M. und Brenneman, D. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease, Brain Res. 854 (2000) 257-262. [66] Ong, W.Y. und Garey, L.J. Distribution of GABA and neuropeptides in the human cerebral cortex. A light and electron microscopic study, Anat. Embryol. 183 (1991) 397-413.
|
[67] Paspalas, C.D. und Papadopoulos, G.C. Noradrenergic innervation of peptidergic interneurons in the rat visual cortex, Cerebral Cortex, 9 (1999) 844-853. [68] Patel, U. Non-random distribution of blood vessels in the posterior region of the rat somatosensory cortex, Brain Res. 289 (1983) 65-70. [69] Pellegri, G., Magistretti, P.J. und Martin, J.-L. VIP and PACAP potentiate the action of glutamate on BDNF expression in mouse cortical neurones, Eur. J. Neurosci. 10 (1998) 272-280. [70] Pincus, D.W., DiCicco-Bloom, E.M. und Black, I.B. Vasoactive intestinal peptide regulates mitosis, differentiation and survival of cultured sympathetic neuroblasts, Nature, 343 (1990) 564-567. [71] Porter, J.T., Cauli, B., Staiger, J.F., Lambolez, B., Rossier, J. und Audinat, E. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex, Eur. J. Neurosci. 10 (1998) 3617-3628. [72] Rhoades, R.W., Crissman, R.S., Bennett-Clarke, C.A., Killackey, H.P. und Chiaia, N.L. Development and plasticity of local intracortical projections within the vibrissae representation of the rat primary somatosensory cortex, J. Comp. Neurol. 370 (1996) 524-535. [73] Rhoades, R.W., Strang, V., Bennett-Clarke, C.A., Killackey, H.P. und Chiaia, N.L. Sensitive period for lesion-induced reorganization of intracortical projections within the vibrissae representation of rat's primary somatosensory cortex, J. Comp. Neurol. 389 (1997) 185-192. [74] Rogers, J.H. Immunohistochemical markers in rat cortex: co-localization of calretinin and calbindin-D28k with neuropeptides and GABA, Brain Res. 587 (1992) 147-157. [75] Said, S.I. und Mutt, V. Isolation from porcine-intestinal wall of a vasoactive octacosapeptide related to secretin and to glucagon, Eur. J. Biochem. 28 (1972) 199-204. [76] Sessler, F.M., Grady, S.M., Waterhouse, B.D. und Moises, H.C. Electrophysiological actions of VIP in rat somatosensory cortex, Peptides, 12 (1991) 715-721. [77] Simons, D.J. Response properties of vibrissa units in rat SI somatosensory neocortex, J. Neurophysiol. 41 (1978) 798-820. [78] Simons, D.J. Neuronal integration in the somatosensory whisker/barrel cortex. In E.G. Jones und I.T. Diamond (Hg.) The barrel cortex of rodents, Plenum Press, New York, 1995, S. 263-297. [79] Somogyi, P. und Cowey, A. Double bouquet cells. In A. Peters und E.G. Jones (Hg.) Cellular components of the cerebral cortex, Plenum Press, New York and London, 1984, S. 337-360. [80] Staiger, J.F., Freund, T.F. und Zilles, K. Local connections among inhibitory neurons in the primary somatosensory cortex of the rat: innervation of neurons containing vasoactive
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intestinal polypeptide (VIP) by different populations of parvalbumin- and VIP-immunoreactive synapses, Ann. Anat. 178 (1996) 49 (Abstract) [81] Staiger, J.F., Freund, T.F. und Zilles, K. Interneurons immunoreactive for vasoactive intestinal polypeptide (VIP) are extensively innervated by parvalbumin containing boutons in rat primary somatosensory cortex, Eur. J. Neurosci. 9 (1997) 2259-2268. [82] Staiger, J.F., Kötter, R., Zilles, K. und Luhmann, H.J. Connectivity in the somatosensory cortex of the adolescent rat: an in vitro biocytin study, Anat. Embryol. 199 (1999) 357-365. [83] Staiger, J.F., Kötter, R., Zilles, K. und Luhmann, H.J. Laminar characteristics of functional connectivity in rat barrel cortex revealed by stimulation with caged-glutamate, Neuroscience Res. (2000) (Im Druck) [84] Staiger, J.F., Zilles, K. und Freund, T.F. The innervation of VIP-immunoreactive neurons by the ventroposteromedial thalamic nucleus in the barrel cortex of the rat, J. Comp. Neurol. 367 (1996) 194-204. [85] Staiger, J.F., Zilles, K. und Freund, T.F. Distribution of GABAergic elements postsynaptic to ventroposteromedial thalamic projections in layer IV of rat barrel cortex, Eur. J. Neurosci. 8 (1996) 2273-2285. [86] Steffen, H. und van der Loos, H. Early lesions of mouse vibrissal follicles: their influence on dendrite orientation in the cortical barrelfield, Exp. Brain Res. 40 (1980) 419-431. [87] Swadlow, H.A., Beloozerova, I.N. und Sirota, M.G. Sharp, local synchrony among putative feed-forward inhibitory interneurons of rabbit somatosensory cortex, J. Neurophysiol. 79 (1998) 567-582. [88] Szentágothai, J. The "module-concept" in cerebral cortex architecture, Brain Res. 95 (1975) 475-496. [89] Tettoni, L., Lehmann, P., Houzel, J.-C. und Innocenti, G.M. Maxsim, software for the analysis of multiple axon arbors and their simulated activation, J. Neurosci. Meth. 67 (1996) 1-9. [90] Valverde, F. Intrinsic neocortical organization: some comparative aspects, Neuroscience, 18 (1986) 1-23. [91] Wahle, P. und Meyer, G. Early postnatal development of vasoactive intestinal polypeptide- and peptide histidine isoleucine-immunoreactive structures in the cat visual cortex, J. Comp. Neurol. 282 (1989) 215-248. [92] Waite, J.J., Holschneider, D.P. und Scremin, O.U. Selective immunotoxin-induced cholinergic deafferentation alters blood flow distribution in the cerebral cortex, Brain Res. 818 (1999) 1-11. [93] Welker, C. und Woolsey, T.A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse, J. Comp. Neurol. 158 (1974) 437-454.
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[94] Welker, E., Armstrong-James, M., Bronchti, G., Ourednik, W., Gheorghita-Baechler, F., Dubois, R., Guernsey, D.L., van der Loos, H. und Neumann, P.E. Altered sensory processing in the somatosensory cortex of the mouse mutant barrelless, Science, 271 (1996) 1864-1867. [95] Welker, E., Armstrong-James, M., van der Loos, H. und Kraftsik, R. The mode of activation of a barrel column: Response properties of single units in the somatosensory cortex of the mouse upon whisker deflection, Eur. J. Neurosci. 5 (1993) 691-712. [96] Welker, E., Rao, S.B., Dörfl, J., Melzer, P. und van der Loos, H. Plasticity in the barrel cortex of the adult mouse: Effects of chronic stimulation upon deoxyglucose uptake in the behaving animal, J. Neurosci. 12 (1992) 153-170. [97] Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry, Brain Res. 171 (1979) 11-28. [98] Wong-Riley, M.T.T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity, Trends Neurosci. 12 (1989) 94-101. [99] Woolsey, T.A., Dierker, M.L. und Wann, D.F. Mouse SmI Cortex: Qualitative and quantitative classification of Golgi-impregnated barrel neurons, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72 (1975) 2165-2169. [100] Woolsey, T.A. und van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (S I) of mouse cerebral cortex, Brain Res. 17 (1970) 205-242. [101] Zhang, Z.W. und Deschenes, M. Intracortical axonal projections of lamina VI cells of the primary somatosensory cortex in the rat: a single-cell labelling study, J. Neurosci. 17 (1997) 6365-6379. [102] Zhu, J.J. und Connors, B.W. Intrinsic firing patterns and whisker-evoked synaptic responses of neurons in the rat barrel cortex, J. Neurophysiol. 81 (1999) 1171-1183. [103] Zilles, K. The cortex of the rat. A stereotaxic atlas, Springer, New York, 1985. [104] Zilles, K., Hajós, F., Csillag, A., Kálmán, M., Sotonyi, P. und Schleicher, A. Vasoactive intestinal polypeptide immunoreactive structures in the mouse barrel field, Brain Res. 618 (1993) 149-154.
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CONVAX ver 2.02 für Windows 95 Convax 2.02 für Windows 95 wurde entwickelt, um mit der Software Neurolucida 2.0 rekonstruierte Zellen in ein gängiges Metafile-Format zu konvertieren. Der Vorteil gegenüber den übrigen Methoden, Neurolucida-Dateien in einem verwertbarem Graphikformat auszugeben, liegt in der größeren Authentizität der durch Convax produzierten Graphikdateien. Die Dicke von Zellfortsätzen wird im Verhältnis korrekt dargestellt. Außerdem sind mit Convax erstellte Dateien effizienter zu bearbeiten als die von Neurolucida exportierten Formate. Zur Bearbeitung stehen mächtige Graphikprogramme unterschiedlicher Anbieter zur Verfügung, wie beispielsweise CorelDraw!, mit dem die in dieser Arbeit enthaltenen Nervenzellabbildungen erstellt worden sind.
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Convax stellt sowohl Einzelzellrekonstruktionen als auch im Kartierungsmodus von Neurolucida erstellte Dateien graphisch dar und gibt sie als Metafiles sowohl im CGM- (Computer Graphics Metafile) als auch im GEM-Format (Graphics Environment Manager) aus. Der Benutzer ist in der Lage, die Zellen um die drei Hauptachsen X, Y und Z zu rotieren sowie die Farben der Strukturen, unterschiedliche Dicken für Varikositäten und Zellfortsätze sowie Schrumpfungsfaktoren in diversen Dialogfenstern einzugeben. Eine ausführliche Online-Hilfefunktion und Referenz sind dem Programm beigefügt.
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Der Quelltext zu Convax wurde von mir in der Programmiersprache C geschrieben. Neben einer Befehlszeilenversion für MS-DOS liegt auch eine Version für die Windows 95/98 Graphical Device Interface mit erweiterten Funktionen vor. Beide Versionen sind sowohl als ausführbare Dateien als auch als Quelltext mit der Erlaubnis zur Weitergabe und Modifikation im Internet unter www-public.rz.uni-duesseldorf.de/bayrakta frei erhältlich.
Neurolucida in der Version 2.0 unterstützte nur unzureichend die retrograde Rekonstruktion von Nervenzellfortsätzen. Obwohl die aus der retrograden Rekonstruktion hervorgehenden Dateien durch Neurolucida korrekt dargestellt wurden, konnten sie beispielsweise nicht in die Auswertungsprogramme NeuRotate oder Morph eingelesen und untersucht werden. Retrax ist ein von mir in C++ geschriebenes Befehlszeilenprogramm, das dem Abhilfe leisten soll. Es organisiert die von Neurolucida nach einer retrograden Rekonstruktion erstellte Datenliste in einer Weise um, dass die resultierende, neue Datenliste sich bis auf Details nicht von der einer konventionell anterograd rekonstruierten Zelle unterscheidet. Die von Retrax hervorgebrachten ASCII-Dateien lassen sich sowohl mit Morph und Convax als auch - nach Konvertierung in das binäre Neurolucida-2.0-Format - mit NeuRotate öffnen und enthalten die gleichen Informationen wie die Ursprungsdateien. Folgendes einfaches Beispiel zeigt die Datenliste* einer Axonrekonstruktion, die an einem beliebigen Punkt im Verlauf des Axon begonnen worden ist (Punkt 2). Folglich ist die Rekonstruktion in zwei Abschnitten durchgeführt worden, zuerst retrograd zurück zum Axoninitialsegment (Punkt 1), danach in entgegengesetzter Richtung zum Ende des Axons (Punkt 3) (Pfeile). Diese Datenliste kann, außer durch Neurolucida, durch keines der genannten Programme geöffnet werden.
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Retrax versetzt den anatomischen Ursprung des Axons, das Axoninitialsegment, aus der Mitte der Datenliste an ihren Anfang. Das Ende des Axons kommt dementsprechend an das Ende der Datenliste. Der Punkt, an dem die Rekonstruktion begonnen wurde, liegt irgendwo in der Mitte der Datenliste und ist nur noch durch den Code [33,21] (old beginning) als solcher zu erkennen. Die entstandene ASCII-Datei kann von allen Programmen geöffnet werden. ![]()
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VIP-immunreaktive Neurone im primär-somatosensorischen Kortex
der adulten Ratte: Immunzytochemische Charakterisierung und dreidimensionale Rekonstruktion
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin,
Vasoaktivem Intestinalem Polypeptid (VIP) im Kortex der Ratte kommt mutmaßlich eine besondere Funktion in der Steuerung und Förderung von Stoffwechselvorgängen und der neuronalen Aktivität von Nervenzellen zu. Es wird überwiegend in bipolaren, senkrecht zur pialen Oberfläche orientierten, GABA (Gamma-Aminobuttersäure) und teilweise auch Cholin-Acetyltransferase enthaltenden Interneuronen exprimiert. Aufgrund ihrer schlanken somatodendritischen Gestalt sind diese Zellen mit isokortikalen kolumnären Organisationsmustern in Verbindung gebracht worden, die mit den Barrels des primär-somatosensorischen Kortex der Ratte ein morphologisches Korrelat besitzen. Um eine Assoziation von VIP-Zellen und Barrels aufzuzeigen, wurde die immunhistochemische Darstellung von VIP in seinen Ursprungszellen und die Darstellung von Barrels durch das Sichtbarmachen ihrer Cytochromoxidase-Aktivität auf histologischen Schnitten durch die Tiefe des primär-somatosensorischen Kortex kombiniert. VIP-Neurone fanden sich in den supragranulären (48% aller VIP-Neurone) und infragranulären Schichten (36%) sowie in den Barrels und den Septa der Granulärschicht (16%). Einzelne Zellen fanden sich auch in der weißen Substanz. Innerhalb der Granulärschicht wurden mehr VIP-Neurone in den Septen zwischen den Barrels als in den Barrels gefunden. Dieser Trend schlug sich in einer Zelldichte nieder, die innerhalb der Barrels um ein Drittel niedriger war als in den Septa. Zur genauen Untersuchung ihrer Gestalt wurden VIP-Zellen aus den unterschiedlichen Schichten mit einem Computermikroskop und der Neurolucida-Software über zusammenhängende Serienschnitte dreidimensional rekonstruiert. Die rekonstruierten Nervenzellen wiesen überwiegend typische Eigenschaften von bipolaren, einfach oder zweifach gebüschelten Neuronen auf. Hinsichtlich der Gestalt des Axons fanden sich schichtenspezifische Unterschiede zwischen 1.) VIP-Neuronen in den supragranulären Schichten, der Granulärschicht und dem oberen Abschnitt der infragranulären Schichten, etwa entsprechend Schicht Va, einerseits und 2.) den VIP-Neuronen im unteren Abschnitt der infragranulären Schichten andererseits. Erstere besaßen Dendriten, die oft bis in die Schicht I hineinragten und sich dort mehrfach dichotom verzweigten, sowie vertikal orientierte Axonbäume, deren tangentialer Durchmesser stets deutlich geringer war als die Breite einer Barrel-Kolumne. Daher blieben sowohl der Dendriten- als auch der Axonbaum dieser Zellen meist auf die Kolumne, in der sich das Soma der Neurone befand, beschränkt. Die VIP-Neurone der zweiten Gruppe hingegen waren gekennzeichnet durch Dendriten, die nicht über die Schicht-IV-V-Grenze hinausreichten, und Axone mit oft langen horizontalen Kollateralen, die sich über zwei oder mehr Barrel-Kolumnen erstreckten. Die genannten Gruppen von VIP-Zellen werden diskutiert als mögliche Anpassung an die unterschiedlichen Formen der Informationsverarbeitung in den entsprechenden Schichten. So modulieren die VIP-Neurone den Gewebestoffwechsel einmal in einer spezifisch afferentierten, umschriebenen Region in den oberen Schichten des Kortex und in einer eher extensiv afferentierten, integrativ arbeitenden, breiteren Region in den unteren Schichten.
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