Aus dem C. und O. Vogt-Institut für Hirnforschung Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. K. Zilles       VIP-immunreaktive Neurone im primär-somatosensorischen Kortex der adulten Ratte: Immunzytochemische Charakterisierung und dreidimensionale Rekonstruktion       Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin Der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Tan Bayraktar 2000

 

Als Inauguraldissertation gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf   gez.: Prof. Dr. Häussinger Dekan   Referent: Prof. Dr. Zilles Korreferent: Prof. Dr. Luhmann

 

Eine elektronische Version dieser Dissertation ist unter http://www.ulb.uni-duesseldorf.de/diss/med/2001/bayraktar.html verfügbar.

 

Meinen lieben Eltern in Dankbarkeit gewidmet.

 

Inhaltsverzeichnis:   Einleitung: 4    VIP-Zellen 4    Der primär-somatosensorische Kortex der Ratte 5    Zielsetzung der Arbeit: Rekonstruktion von VIP-Zellen im Barrel-Kortex 9     Material und Methoden: 10    Herstellung der Präparate 10    Immunhistochemie 10    Cytochromoxidase-Histochemie 11    Zellkartierung 11    Rekonstruktion der Neurone 12     Ergebnisse: 17    Qualität der Präparate 17    Zellverteilung 20    Morphologie von VIP-Neuronen 21       Dendriten 21       Axone 23    Schichtenabhängige Unterschiede zwischen den Zellen,    räumliche Beziehung zu Kolumnen 25     Diskussion: 41    Kritische Beurteilung der angewandten Methodik 41    Die Morphologie von VIP-Neuronen 42    Räumliches Verhältnis der Zellen zu den Barrels 43    Die Funktion von VIP-Neuronen im Barrel-Kortex 46     Zusammenfassung: 50 Danksagung: 51 Literaturverzeichnis: 52     Anhang: Programme 60    CONVAX ver 2.02 für Windows 95 60    RETRAX 61     Lebenslauf:   63   3

 

Einleitung:   Seit über einem Jahrhundert ist die einzelne Nervenzelle als elementares Glied der neuronalen Informationsverarbeitung ein zentraler Gegenstand der Hirnforschung. Wenngleich angesichts technologischer Fortschritte und verfeinerter funktioneller Untersuchungsmethoden die Physiologie von Nervenzellen und Nervenzellverbänden in den Vordergrund gerückt worden ist, ist nach wie vor die Gestalt einer Nervenzelle von unzweifelhafter Relevanz für das Verständnis ihrer Funktion. Thema dieser Dissertationsarbeit ist es, eine bestimmte Population von Nervenzellen aufgrund ihrer Gestalt in Beziehung zu bestehenden funktionellen Entitäten zu setzen und anhand dieser Beziehung weitere Aussagen über die Funktion dieser Nervenzellen herzuleiten. Die Zellen sind charakterisiert durch Immunreaktivität mit Antikörpern gegen Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP; die Zellen werden im Folgenden VIP-Zellen oder VIP-Neurone genannt), das von ihnen produziert wird, um es vermutlich als stoffwechsel- und neuromodulatorische Substanz in den Extrazellulärraum freizusetzen. Neben anderen Lokalisationen kommen sie im gesamten Neokortex vieler Säugetiere [3,34,55,62,91] und auch des Menschen [13,30,66] vor. Für diese Arbeit wurden ausschließlich VIP-Zellen aus dem primär-somatosensorischen Kortex der adulten Ratte untersucht.   VIP-Zellen Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) ist erstmals von Said und Mutt aus dem Duodenum des Schweines isoliert worden [75]; seinen Namen verdankt es seiner dilatierenden Wirkung auf die Gefäße des Magen-Darm-Traktes. Neben weiteren Lokalisationen innerhalb des Verdauungsapparates, oft in Assoziation mit cholinergen Fasern des autonomen Nervensystems [53], findet man VIP unter anderem auch innerhalb des zentralen Nervensystems, und dort vor allem in der Hirnrinde [55]. Innerhalb des Kortex kommt VIP überwiegend in streng vertikal zur Pia ausgerichteten, bipolaren Nervenzellen vor. In ihrer Ausdehnung erstrecken sich VIP-Zellen oftmals über mehrere kortikale Schichten [25,39,62]. Diese Eigenschaft ist hinweisend auf eine integrative Funktion der Zellen im funktionellen Gefüge von kortikalen Kolumnen, vertikal angeordneten Zellverbänden, die durch vergleichbar geartete Reaktionen auf einen Stimulus verifizierbar eine relative funktionelle Einheit bilden [63,88]. Neben diesen morphologischen Auffälligkeiten tragen zahlreiche mit VIP in Verbindung gebrachte physiologische Effekte zum Interesse an den Zellen bei. VIP wird kalziumabhängig aus der Zelle freigesetzt [59]; Rezeptoren für diese Substanz befinden sich auf Nervenzellen, Astrozyten und Gefäßwänden [60]. Spezifische Antagonisten von VIP sollen existieren [36]. Die Axonterminalen von VIP-Zellen zeigen eine deutliche Assoziation mit kortikalen Blutgefäßen [21]. Physiologische Experimente wiesen auf eine Dilatation von hirneigenen Gefäßen nach Gabe von VIP hin und bekräftigten die Vorstellung, dass VIP-Zellen sich an der Durchblutungsregulation im Kortex beteiligen [41,61], im Zusammenspiel mit anderen Systemen, wie zum Beispiel dem aus dem Nucleus basalis Meynert aufsteigenden cholinergen Fasersystem [27,92]. Insbesondere der Arbeitsgruppe um Magistretti ist es zu verdanken, dass zahlreiche andere modulierende Einflüsse von VIP auf den Hirnstoffwechsel beleuchtet worden sind. Ihre Experimente führten zu dem Schluss, dass VIP synergistisch mit Noradrenalin das 4

 

intrazelluläre cAMP in kortikalen Nervenzellen und Astrozyten erhöhen kann mit der Konsequenz einer Mobilisierung von Glykogen und einer Erhöhung des Zellstoffwechsels [58]. Durch die komplementäre Lokalisation von VIP in kortikalen Zellen mit streng lokalem Einfluss einerseits und von Noradrenalin in den Kortex umfassenden, aufsteigenden Fasern aus dem subkortikalen Locus coeruleus andererseits ist es vorstellbar, dass neben einer globalen Aktivierung des Kortex durch Noradrenalin VIP-Zellen diese Aktivierung noch einmal streng lokal, dem Bedarf entsprechend, im Sinne von "Hot spots" steigern und feinregulieren können [57]. Synapsen zwischen noradrenergen Fasern und VIP-Neuronen sind vor kurzem elektronenmikroskopisch nachgewiesen worden [67] und lassen eine Interaktion zwischen dem noradrenergem Fasersystem und dem lokalen VIP-System vermuten. Erwähnenswert ist außerdem, dass VIP die Verstärkung der Expression von BDNF (brain-derived neurotrophic factor) [69] und die Förderung des embryonalen Wachstums und des überlebens von Nervenzellen [15,37,65,70] zugeschrieben wird. Somit scheint VIP in der Regulation von unterschiedlichen Stoffwechselvorgängen innerhalb des Nervengewebes eine bedeutsame Rolle zuzukommen. Im Verhältnis zu den stoffwechselaktiven Funktionen von VIP sind die neuromodulatorischen Eigenschaften dieses Polypeptids bislang wenig beachtet worden. An Neuronen ist VIP in der Lage, die Wirkung anderer, klassischer Neurotransmitter zu modulieren, wiederum synergistisch mit Noradrenalin, aber auch mit Acetylcholin [64,76], das in einem Drittel aller VIP-Zellen zusätzlich produziert wird [10,20]. Ferner bedeutsam ist die Erkenntnis, dass alle VIP-Zellen im Neokortex zugleich auch (-Aminobuttersäure (GABA), den wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im ZNS, enthalten [10,44,71] und somit selbst inhibitorisch wirksam sind. Betrachtet man alle den VIP-Zellen zugeschriebenen Funktionen, sowohl die stoffwechselaktivierenden wie auch die neuromodulatorischen und inhibitorischen Eigenschaften, liegt es nahe, in VIP-Zellen eine wirksame Instanz zur Anpassung allgemeiner kortikaler Aktivität, dem Bedarf in einem bestimmten kortikalen Abschnitt entsprechend, zu sehen.   Der primär-somatosensorische Kortex der Ratte Der primär-somatosensorische Kortex der adulten Ratte (S1, im folgenden Par1 nach der Nomenklatur von Zilles und Wree [103]) [93], ebenso wie der der Maus [100] und anderer Nagetiere [87], besitzt eine Architektur, die es gestattet, funktionell fassbare kortikale Kolumnen mit Hilfe von morphologischen Mitteln zuverlässig abzugrenzen. Ein parallel zur Pia mater geführter Schnitt (diese Schnittrichtung wird im Folgenden als tangential bezeichnet) durch Schicht IV läßt bereits im nach Nissl gefärbten Standartpräparat ein honigwabenähnliches Muster von Flächen mit einer erhöhten Zelldichte in der Granulärschicht erkennen [93] (Abb. 1). Diese Flächen, in der Literatur gängig als Barrels bezeichnet, werden voneinander durch hellere Streifen, den Septa, getrennt, deren Zelldichte der des übrigen Kortex entspricht [93]. Das Barrel-Muster hat dem primär-somatosensorischen Kortex der Ratte den Namen Barrel-Kortex eingebracht. Die Anordnung der zelldichten Barrels im Tangentialschnitt ähnelt weitgehend der Anordnung der langen Tasthaare der Ratte, den Vibrissen, auf der kontralateralen Seite ihrer Schnauze, in somatotoper Entsprechung [6,96,100] (Abb. 1). 5

 

Abb. 1: Das Vibrissenfeld und der kontralaterale Barrel-Kortex der Ratte. A: Der Kopf einer Ratte mit dem Vibrissenfeld und den langen Vibrissen. Taktile Informationen aus dem Vibrissenfeld werden nach Umschaltung im Trigeminus-Kernkomplex und im Thalamus in das posteromediale Barrel-Unterfeld (PMBSF) im parietalen Kortex der kontralateralen Hemisphäre weitergeleitet. In der vorliegenden Zeichnung sind die Barrels auf die Rindenoberfläche projiziert dargestellt. B: Die Anordnung der langen Tasthaare an der Schnauze der Ratte folgt einem recht konstanten Schema. Die Vibrissen liegen in Reihen, die von dorsal nach ventral mit den Buchstaben A - E gekennzeichnet sind, angeordnet vor. C: Vergrößerte schematische Darstellung des PMBSF. Gegenüber A ist diese Zeichnung um etwa 130° im Uhrzeigersinn gedreht, um die Entsprechungen zur Anordnung der Vibrissen, wie sie in B gezeigt ist, deutlich zu machen. Die Barrel-Reihen sind mit Buchstaben gekennzeichnet. Die Barrel-Bögen verlaufen orthogonal zu diesen. Die zu einem Bogen gehörenden Barrels sind durch gleiche Ziffern markiert. Die mit griechischen Buchstaben bezeichneten Barrels gehören keiner der fünf Barrel-Reihen an. Akürzungen: m - medial, l - lateral, r - rostral, k - kaudal.      6

 

Die Vibrissen stellen die wichtigsten Tastorgane der Ratte dar. Durch aktives Bewegen der Vibrissen ist die Ratte in der Lage, ihre nächste Umgebung in sehr sensibler Weise tastend zu erfassen. Physiologische Experimente haben gezeigt, dass ein Barrel in einer bestimmten Position innerhalb des Barrel-Feldes den stärksten sensorischen Stimulus aus dem Tasthaar in entsprechender Position innerhalb des kontralateralen Vibrissenfeldes erhält [6,77,95,102]. Gleichartige, ebenfalls morphologisch darstellbare Somatotopien sind für das Kerngebiet des Nervus trigeminus [9,31] und den Nucleus ventralis posteromedialis thalami [51] beschrieben. Nervenzellen oberhalb und unterhalb eines Barrels in Par1 lassen sich ebenfalls aufgrund ihrer Reaktion auf einen peripheren Stimulus dem gleichen Tasthaar zuordnen [7,77,95]. Diese Beobachtungen führten zu der Auffassung, dass es sich bei den Schicht-IV-Barrels um morphologische Korrelate von kortikalen Kolumnen handelt. Entsprechend werden im Folgenden die Rindenbereiche oberhalb und unterhalb eines Barrels zusammen mit dem dazugehörenden Barrel in der Granulärschicht (Schicht IV) als Barrel-Kolumne zusammengefasst (Abb. 2). Ebenso wird das Kortexgewebe oberhalb und unterhalb eines Septums als septale oder Septum-assoziierte Kolumne bezeichnet. Es bestehen Hinweise dafür, dass sich das Wesen einer Barrel-Kolumne als neuro-funktionelle Einheit auch in ihrer Gefäßversorgung niederschlägt. So ist das Gefäßnetz in den Barrels dichter als in den Septa [26,68], und die Reizung von bestimmten Vibrissen scheint selektiv den Blutfluss in den entsprechend zugeordneten Barrels zu erhöhen [26].     Abb. 2: Schematische Darstellung eines Ausschnitts aus dem Barrel-Kortex der Ratte. Dargestellt sind zwei senkrecht zur Pia mater angeschnittene Barrels, die zusammen mit dem darüber und darunter gelegenen Gewebe jeweils eine Barrel-Kolumne bilden. Die Barrels werden voneinander durch Septen getrennt. Das Septum wird mit dem entsprechenden Gewebe oberhalb und unterhalb davon als Septum-assoziierte Kolumne bezeichnet. 7

 

Barrels lassen sich außer mit der Nissl-Färbung auch darstellen, indem man die Aktivität von Enzymen des Energiemetabolismus, beispielsweise der Cytochromoxidase [5,32,73], aber auch der Succinat-Dehydrogenase [45], sichtbar macht. In den Barrels endet der größte Teil spezifischer somatosensorischer Afferenzen aus dem Nucleus ventralis posteromedialis des Thalamus als ein dichtes Netz von Fasern [54,84,94]. Diese starken Afferenzen führen zu einem gesteigerten Stoffwechsel in den Dendriten der nachgeschalteten kortikalen Neurone innerhalb der Barrels [98], im Gegensatz zu den umgebenden Bereichen, die keine spezifischen thalamokortikalen Afferenzen erhalten. Darüberhinaus hat sich herausgestellt, dass die synaptischen Boutons thalamokortikaler Afferenzen zahlreiche Mitochondrien enthalten [85]. Cytochromoxidase, ein mitochondriales Enzym der Atmungskette, kann deshalb innerhalb der Boutons und der afferentierten Dendriten in erhöhter Aktivität nachgewiesen und mit Hilfe einer histochemischen Reaktion sichtbar gemacht werden [98]. Der spezifische Vorteil gegenüber der Darstellung der Barrels durch die Nissl-Färbung liegt in der diskreteren Färbung der Strukturen als Hintergrund, der mit anderen Zellen, die zum Beispiel durch eine Immunreaktion dargestellt werden können, relativ wenig interferiert. Aufgrund seiner herausragenden morphologischen Architektur hat sich der Barrel-Kortex als beliebtes Versuchsobjekt und Modell zur Untersuchung des kortikalen Informationsflusses und zur Plastizität von Kolumnen etablieren können [4,7,72,96]. Als primär-sensorisches Hirnrindenareal ist der Barrel-Kortex frühzeitig in den Verarbeitungsprozess taktiler Informationen eingebunden. Das Muster der Barrels ermöglicht es, funktionell zusammenhängende, die ganze Dicke des Kortex umfassende, kolumnäre Zellverbände mit einfachen morphologischen Mitteln abzugrenzen. Dabei stehen Befunde zur Verfügung, die es gestatten, den voneinander differenzierbaren Kompartimenten des Barrel-Kortex, nämlich den Barrels und Septa zusammen mit den damit assoziierten Kolumnen (Abb. 2), unterschiedliche Funktionen innerhalb der kortikalen Datenverarbeitung zuzuordnen. So werden die Barrels als eine informationsverarbeitende Station in einem Datenfluss mit spezifischem, stark somatotopem Inhalt gesehen. Die vorgeschalteten Relaisstellen mit somatotoper Ordnung zwischen Vibrissenfeld und Neokortex sind das Trigeminus-Kerngebiet (insbeondere der Nucleus principalis nervi trigemini) und der Nucleus ventralis posteromedialis thalami [22,23,48]. Im Gegensatz dazu erhalten die Barrel-Septen unspezifischere Informationen, die auf dem Weg vom Vibrissenfeld zum Kortex überwiegend im Subnucleus interpolaris nervi trigemini und danach im Nucleus posterior thalami weitergeschaltet worden sind [22,23,48]. Auch hinsichtlich der Efferenzen unterscheiden sich die Neurone in den Barrels von denen in den Septen. Während die intrinsischen Axone der Zellen in einer Barrel-Kolumne lokal weitgehend begrenzt bleiben und ihre Projektionen innerhalb des Barrel-Kortex über die jeweils unmittelbar benachbarten Barrel-Kolumnen nicht hinausgehen [46], bilden Zellen in Septum-assoziierten Kolumnen horizontale Axonkollateralen aus, die über mehrere Barrels hinweg andere septale Kolumnen erreichen [46,72]. Die Darstellung dieser intrinsischen Faserverbindungen auf Tangentialschnitten durch Schicht IV des Barrel-Kortex führt zu einem Bild, in dem die Barrels von Fasern verhältnismäßig ausgespart sind [72]. 8

 

Zielsetzung der Arbeit: Rekonstruktion von VIP-Zellen im Barrel-Kortex Zilles und Mitarbeiter [104] haben an der Maus gezeigt, dass die Anordnung von VIP-immunreaktiven Strukturen innerhalb des Barrel-Kortex, wie schon für GABAerge Zellen im Allgemeinen beschrieben [24], in einer bestimmten örtlichen Beziehung zu einzelnen Barrels steht. Demzufolge sind VIP-immunreaktive Strukturen in den Barrel walls, bestehend aus dem Septum und den bei der Maus Barrel sides genannten peripheren Bereichen der Barrels [100], relativ konzentriert im Gegensatz zu den eher lichteren Barrel-Zentren [104]. Es ist zu vermuten, dass mit diesem spezifischen Verteilungsmuster eine funktionelle Assoziation von VIP-Neuronen und Barrels einhergeht. Gelänge der Nachweis dieser Assoziation, ließe sie sich möglicherweise auch auf andere Bereiche des Kortex extrapolieren, die ebenfalls kolumnären Organisationsprinzipien unterliegen, auch wenn diese morphologisch nicht so einfach zu erfassen sind wie anhand der Barrels im primär-somatosensorischen Kortex. VIP-Zellen sind bereits in unterschiedlichen Hirnrindenarealen rekonstruiert worden, so vor allem im primär-visuellen Kortex der Ratte [25] und der Katze [91] sowie dem motorischen Kortex [43,71] und dem Hippocampus der Ratte [1]. Komplette Rekonstruktionen insbesondere des Axonbaumes von VIP-Zellen aus dem primär-somatosensorischen Kortex der Ratte hingegen standen noch aus. Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit war es daher, die räumliche Beziehung von VIP-Zellen zu Barrels durch Einzelzellrekonstruktionen zu beleuchten. VIP-Zellen wurden durch Immunhistochemie dargestellt und mit Hilfe einer konventionellen Camera lucida, überwiegend aber dreidimensional mit einem Computermikroskop und der kommerziell vertriebenen Software Neurolucida 2.1 (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) [35] rekonstruiert. Auf den gleichen Hirnschnitten wurden Barrels durch Darstellung der Cytochromoxidaseaktivität der Präparate sichtbar gemacht. Die räumliche Beziehung der Zellen zu den Barrels wurde durch computergestützte Rotation und Betrachtung der Rekonstruktionen aus unterschiedlichen Blickrichtungen ermittelt. Im Folgenden werden wesentliche Unterschiede zwischen VIP-Neuronen, die sich in unterschiedlichen Schichten des Isokortex befinden, aufgezeigt. Außerdem soll dargestellt werden, in welchem Ausmaß sich die Lokalisation einer VIP-Zelle in Beziehung zu einem Barrel in der Gestalt und Ausdehnung der Zelle niederschlägt. Rückschlüsse von der Gestalt auf die Funktion der Nervenzellen werden erörtert und diskutiert. Wesentliche Teile dieser Dissertationsarbeit sind bereits veröffentlicht worden [11,12].       9

 

Material und Methoden:   Herstellung der Präparate Ausgewachsene männliche Wistar-Ratten (n=7, Körpergewicht zwischen 250-300 g) wurden durch eine überdosis intraperitoneal injizierten Pentobarbitals betäubt und durch die Aorta ascendens mit einer Lösung aus 4% Paraformaldehyd und 0,2% Pikrinsäure in 0,1-molarem Phosphatpuffer (PP) perfundiert. Die Hirne wurden herauspräpariert und mit einem Vibratom in 50 µm dicke Serienschnitte geschnitten. Die Schnittrichtung entsprach bei vier Tieren der von Standard-Koronarschnitten. Die Gehirne der drei anderen Tiere wurden parallel zu einer Ebene geschitten, die senkrecht zu den Barrel-Reihen (engl. Barrel rows, Abb. 1) und parallel zu den Barrel-Bögen (engl. Barrel arcs) orientiert war und eine klare Abgrenzung von Barrels und den Septa dazwischen gestattete [93] (Abb. 3). Nach ausgiebiger Spülung in PP wurde das Gewebe für die Dauer von einer Stunde in ein Kryoprotektivum aus 25% Saccharose und 10% Glyzerol in 0,01-molarem PP getaucht. Danach wurde es dreimal sequenziell über flüssigem Stickstoff gefroren und wiederaufgetaut. Anschließend wurden die Schnitte mehrere Male in PP und danach in TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TPS, 0,05 M, pH 7,4) gespült.      Abb. 3: Schnittrichtung durch die Hemisphären des Rattenhirns zur Darstellung der Barrels. Wird das Vibratom im 45°-Winkel zur Koronarebene geführt, wie in der Abbildung dargestellt, so wird das PMBSF parallel zu den Barrel-Bögen zerschnitten. Abkürzungen: k = kaudal; r = rostral.        Immunhistochemie Nach Präinkubation in normalem 10%igem Ziegenserum (Vector, Burlingame, USA; in TPS, pH 7,4) wurde das Gewebe 36-48 Stunden lang dem Primärantikörper gegen VIP (von Dr. T. Görcs [38] im Kaninchen gewonnen und großzügig zur Verfügung gestellt) bei 6° C ausgesetzt. Anschließend wurden die Schnitte viermal 15 Minuten lang in TPS gespült und zwei 10

 

Stunden lang dem Sekundärantiserum mit biotinilierten, gegen Kaninchenproteine gerichteten Antikörpern von der Ziege ausgesetzt. Nach erneuter Spülung in TPS (pH 7,4; viermal 15 Minuten) wurde das Gewebe für die Dauer von zwei Stunden in einen Avidin-biotinilierten Meerrettichperoxidase-Komplex (ABC; 1:200; Vector) getaucht. Die Inkubation wurde durch eine weitere Spülung der Schnitte beendet, zunächst zweimal 15 Minuten lang in TPS (pH 7.4), dann zweimal 15 Minuten lang in 0,05 M TRIS-Puffer (TP; pH je nach weiterer Prozedur 8,2 für DAB-Ni oder 7,6 für einfaches DAB). Der TP wurde ersetzt durch 1 ml/Gläschen einer Chromogen-Lösung, hergestellt entweder aus 7,5 mg 3'-3-Diaminobenzidin-4HCl (DAB; Sigma, München) und 200 mg Nickelammoniumsulfat (Fluka, Schweiz) in 50 ml TP, oder aus einfachem DAB in TP (5 mg/10 ml). Nach abgeschlossener Präinkubation wurde die färbende Peroxidase-Reaktion gestartet, indem den Schnitten eine geeignete Menge an H2O2 zugefügt wurde. Die Reaktion wurde nach Erreichen einer angemessenen Färbeintensität der Nervenzellen durch mehrfaches Spülen der Hirnschnitte in TP (pH 8,2 bzw. 7,6) wieder beendet. Schließlich wurde das Gewebe noch zweimal 10 Minuten lang in PP (0,1 M; pH 7,4) gespült.   Cytochromoxidase-Histochemie Auf dem Gewebe, das senkrecht zu den Barrel-Reihen geschnitten worden war, wurden nach Beendigung der Immunhistochemie die Barrels mit Hilfe von Cytochromoxidase-Histochemie dargestellt. Dazu wurde das Färbeprotokoll nach Wong-Riley [97] mit geringen Modifikationen wie folgt angewandt: Die Hirnschnitte wurden in eine Inkubationslösung aus 6 mg Cytochrom C, 5 mg DAB und 444 mg Saccharose in 10 ml PP bei 37° C getaucht. Die Inkubation wurde beendet, als das braune Reaktionsprodukt in einer Intensität vorlag, die es einerseits gestattete, Barrels abzugrenzen, und andererseits optisch nicht mit den zu rekonstruierenden Nervenzellstrukturen interferierte. Die DAB-Färbung der Schnitte wurde intensiviert durch eine Lösung aus 1% OsO4 und 7% beta-D-(+)Glukose in 0,1 M PP. Nach 45 Minuten wurden das OsO4 entfernt und die Schnitte erneut in PP gespült. Anschließend wurde das Gewebe in einer aufsteigenden Ethanol-Reihe entwässert, mit zwischengeschalteter Immersion der Schnitte in Uranylacetat nach dem 70%-Ethanol-Schritt. Schließlich wurde das Gewebe in Propylenoxid getaucht, in Durcupan (ACM, Fluka, Schweiz) über Nacht eingebettet und anschließend auf Objektträger aufgezogen, gedeckelt und bei 60° C unter Kompression 16 Stunden lang ausgehärtet.   Zellkartierung Auf sieben mit der Cytochromoxidase-Reaktion gefärbten Schnitten von drei Tieren wurde mit Hilfe eines Computer-Mikroskops und der Software Neurolucida (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) [35] der primär-somatosensorische Kortex nachgezeichnet. Unter Anwendung eines Objektivs mit zehnfacher Vergrößerung wurden alle innerhalb einer Fokusebene erkennbaren VIP-Zellen in die entsprechenden Zeichnungen eingefügt. Das Rindengebiet wurde anhand des Cytochromoxidase-Reaktionsmusters seiner Tiefe nach in unterschiedliche Bereiche eingeteilt, nämlich in 1.) die supragranulären Schichten, 2.) die Granulär- 11

 

schicht, in der wiederum a) Barrels und b) Septa abgegrenzt werden konnten, sowie 3.) die infragranulären Schichten (Abb. 2). Die Grenzen dieser Bereiche wurden ebenfalls den Zeichnungen hinzugefügt. In dieser Art wurden von jedem der sieben Hirnschnitte drei unterschiedliche Zeichnungen angefertigt, um den bei der Abgrenzung der Bereiche auftretenden Variabilitäten Rechnung zu tragen. Mit Hilfe der Berechnungssoftware Morph (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) wurden auf jeder der einundzwanzig Zeichnungen die Flächen der oben genannten Bereiche des primär-somatosensorischen Kortex berechnet und die Anzahl der in diesen Bereichen gelegenen VIP-Zellen ermittelt. Die Mittelwerte einander entsprechender Flächen und Zellzahlen der drei Zeichnungen von jedem Hirnschnitt wurden gebildet. Für die weitere Berechnung wurden nur diese Mittelwerte herangezogen. Zum besseren Vergleich der einzelnen Rindenbereiche wurden die Zelldichten als Verhältnis zwischen der Anzahl der Zellen und der Fläche des Bereichs, in dem die Zellen lokalisiert waren, berechnet [Anzahl der Neurone / mm²].   Rekonstruktion der Neurone In einem frühen Stadium dieser Untersuchung wurden VIP-Neurone (n=12) von koronaren Serienschnitten ohne vorhergehende Darstellung der Barrels durch eine Cytochromoxidase-Reaktion mit Hilfe einer konventionellen Camera lucida abgezeichnet. Alle weiteren in diese Arbeit eingegangenen VIP-Zellen (n=51) wurden von mit einer Cytochromoxidase-Reaktion gefärbten Serienschnitten an einem Computer-Mikroskop unter Verwendung der Neurolucida-2.1-Software (Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) rechnergestützt dreidimensional rekonstruiert. Die für diese Aufgabe benutzten Geräte sind in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Das Kernstück ist ein Lichtmikroskop, dessen Objekttisch mit Hilfe dreier Elektromotoren präzise von einem sogenannten Stage-Controller entlang der drei Achsen des Raumes bewegt werden kann. Der Stage-Controller wiederum kann manuell durch einen Joystick oder automatisch während der Zellrekonstruktion durch den angeschlossenen Computer angesteuert werden. Zum Rekonstruieren einer Zelle ist es erforderlich, das Abbild des Präparates und die Zeichnung mit dem Zeicheninstrument, dem Zeichencursor des Computerprogramms, gleichzeitig und übereinander projiziert darzustellen. Dazu stehen zwei alternative Möglichkeiten zur Verfügung. Zum einen kann das Abbild des mikroskopischen Präparates durch eine in den Strahlengang des Mikroskopes eingeschaltete CCD-Kamera in den Computer gespeist und durch diesen dargestellt werden. Der Untersucher zeichnet dann am Monitor die Umrisse des Präparates mit Hilfe der Computermaus ab (Abb. 4, 6). 12

 

1   Lichtmikroskop 2 Motoren zum Bewegen des Objekttisches in X- und Y-Richtung 3 Motor zum Bewegen des Objekttisches in Z-Richtung / Feintrieb zum Scharfstellen des Präparates 4 CCD-Kamera 5 Stage-Controller zur automatischen Bewegung des Objekttisches 6 Personal Computer 7 Joystick zur Ansteuerung des Objekttisches über den Stage-Controller 8 Computer-Maus zum Anklicken und Zeichnen einer Struktur   Abb. 4: Erforderliche Hardware zum Betrieb des Neurolucida-Systems. Der Objekttisch des Mikroskops wird mittels dreier Motoren durch den Stage-Controller bewegt. Der Stage-Controller wiederum kann unmittelbar mit Hilfe des Joystick und mittelbar über den Computer und das Neurolucida-Programm angesteuert werden. Das mikroskopische Abbild des Präparates wird über eine CCD-Kamera in den PC gespeist und auf dessen Monitor dargestellt. Der Untersucher zeichnet mit Hilfe der Maus die Umrisse des mikroskopischen Objektes am Monitor ab. Muss die Zeichnung jenseits des dargestellten Bereiches fortgesetzt werden, übermittelt Neurolucida dem Stage-Controller ein Signal, den Objekttisch in entsprechender Richtung weiterzubewegen. 13

 

Alternativ wird das Computerbild mit geöffnetem Neurolucida-Programmfenster durch einen in den modifizierten Zeichenarm einer konventionellen Camera lucida eingebauten Mikromonitor in den Strahlengang des Mikroskopes eingeblendet (Lucivid). Der Untersucher sieht dann beim Blick ins Okular des Mikroskops sowohl das Präparat als auch das Neurolucida-Applikationsfenster zusammen mit dem Zeichencursor (Abb. 5). Bei beiden Systemen bewegt der Computer über den Stage-Controller den Objekttisch weiter, sobald der aktuell eingestellte Präparateausschnitt abgezeichnet ist, so dass lückenlos am nächsten Ausschnitt weitergezeichnet werden kann. Die Zellen werden von der Software als Objekte gespeichert, die aus Verbindungslinien definierter Dicke zwischen Punkten in einem dreidimensionalen Koordinatensystem gebildet werden (Abb. 6). Beide geschilderten Systeme kamen im Rahmen der vorliegenden Arbeit zur Anwendung.      Abb. 5: Blick durch das Okular des Rekonstruktionsmikroskops beim Lucivid-System. Das Neurolucida-Programmfenster wird mitsamt Zeichencursor auf das Abbild des Präparates projiziert. Mit Hilfe des Zeichencursors kann der Untersucher nun die Umrisse der Zelle abzeichnen.        Zur Rekonstruktion wurden insbesondere solche Zellen ausgewählt, die sich in der Nähe der Grenze einer Barrel-Kolumne befanden, um eventuelle Asymmetrien in der Gestalt einer Zelle aufzuzeigen, die sich möglicherweise aus dieser Nähe ergaben. Erwies sich eine Zelle im Verlauf der Untersuchung als offensichtlich nur sehr unvollständig rekonstruierbar, so wurde diese Zelle nicht weiterverfolgt, sondern ignoriert. Die Anzahl der in den unterschiedlichen kortikalen Schichten rekonstruierten VIP-Neurone wurde ursprünglich so gewählt, dass sie im Verhältnis der Anzahl der Zellen entsprach, die während der Zellkartierung in der gleichen Schicht ermittelt worden war. Um bestimmte Kennzeichen der VIP-Neurone in der Granulärschicht und in den infragranulären Schichten näher zu beleuchten, wurden in diesen Schichten allerdings relativ mehr Zellen rekonstruiert, als man nach der ursprünglichen Vorgabe erwarten sollte. Insgesamt wurden 63 VIP-Zellen rekonstruiert, von denen sich 27 (entsprechend 43%) in den supragranulären Schichten, 12 (19%) in der Granulärschicht, 23 (37%) in den infragranulären Schichten und 1 Zelle in der weißen Substanz befanden. Um eine möglichst 14

 

vollständige Rekonstruktion der Nervenzellen zu gewährleisten, wurden die Fortsetzungen von Zellfortsätzen und Perikarya, die an der Schnittoberfläche unterbrochen worden waren, im Folgeschnitt aufgesucht und weiterverfolgt. Dabei diente das Muster von Gefäßprofilen an der entsprechenden Stelle als Orientierungshilfe, um die Fortsetzung einer bestimmten, verfolgten Struktur eindeutig als solche zu identifizieren. Zur Auswertung wurden die Zellrekonstruktionen mit Computerprogrammen wie z.B. der Maxsim-Simulationssoftware [89], Neurotate (kommerziell vertrieben durch Microbrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) oder Convax (T. Bayraktar, Freeware) der Orientierung auf Tangentialschnitten entsprechend rotiert. Angestrebt wurde dadurch eine genauere Beurteilbarkeit der räumlichen Beziehung der rekonstruierten VIP-Neurone zu den Barrels, die ebenfalls auf den Dateien abgebildet waren. Die in dieser Dissertationsarbeit abgebildeten Zellen wurden mit Neurolucida rekonstruiert, unter Verwendung der Software Convax 2.02 (T. Bayraktar, Anhang) in ein gängiges Metafile-Format konvertiert und mit dem Zeichenprogramm CorelDraw! 6.0 (Corel Corporation, Canada) bearbeitet und ausgedruckt, um eine möglichst authentische Darstellung der Zellen zu erreichen.     Abb. 6: Das Funktionsprinzip von Neurolucida. Das mikroskopische Abbild des Präparates wird über eine CCD-Kamera in einen an das Mikroskop gekoppelten Rechner gespeist. Der Untersucher bewegt den Objekttisch mit Hilfe eines Joystick und stellt so den gewünschten Ausschnitt des Präparates, im Beispiel eine Zelle, scharf ein. Die Bewegungen des Objekttisches werden vom Computer registriert als Bewegungen entlang der Achsen eines dreidimensionalen Koordinatensystems im Verhältnis zu einem fixen Referenzpunkt, der den Ursprung des Koordinatensystems darstellt. Um eine Struktur nachzuzeichnen, klickt der Untersucher entsprechende Punkte des Präparateabbildes am Monitor mit Hilfe der Maus an. Der Computer stellt anhand der Stellung des Objekttisches die Koordinaten der einzelnen Punkte fest und trägt sie in eine Liste ein. Als Information zu jedem Punkt werden die Art der aktuellen Struktur, etwa ein Perikaryon oder ein Dendrit, die Koordinaten dieses Punktes und die Dicke der nachgezeichneten Linie gespeichert (siehe Fußnote im Anhang). Durch Verbinden der einzelnen Punkte dieser Liste ist es dann möglich, die gesamte Kontinuität einer Zelle im Sinne einer Vektorgraphik darzustellen. Kasten: Die Bewegungen des Objekttisches. A) Die dargestellte Zelle wird der Länge nach abgefahren, der Objekttisch wird in der Horizontalen entlang der X-Achse bewegt. Die einzelnen zum Abzeichnen der Zelle eingestellten und angeklickten Punkte des Präparates unterscheiden sich vor allem in den Werten der X-Koordinaten. B) Der Objekttisch wird zum Schärfstellen des Präparates nach unten bewegt. Die entsprechenden Koordinaten unterscheiden sich voneinander vor allem in den Werten der Z-Koordinaten.   15

 

Abb. 6 16

 

Ergebnisse:   Qualität der Präparate Die oben beschriebene Versuchsanordnung ergab Serienschnitte, auf denen die VIP-immunreaktiven Strukturen klar und zusammenhängend rekonstruierbar waren (Abb. 7, 8), und auf denen andererseits das Barrel-Muster nach der Cytochromoxidase-Reaktion hinreichend deutlich erkennbar war. Die Cytochromoxidase-Reaktion gestattete eine sichere Unterscheidung zwischen supragranulären und infragranulären Schichten und der dazwischen liegenden Granulärschicht mit differenzierbaren Barrels und Septa (Abb. 7). Eine genauere Abgrenzung des isokortikalen Schichtenmusters war hingegen schwer möglich, da das Erfordernis von Serienschnitten für die möglichst vollständige Rekonstruktion von VIP-Zellen die Färbung von einzelnen Schnitten einer Serie nach Nissl nicht gestattete. Eine Unterscheidung zwischen den infragranulären Schichten V und VI wurde, sofern erforderlich, grob durch den Vergleich mit Nissl-Schnitten von anderen Tieren vorgenommen.   Abb. 7: Darstellung von VIP-Zellen und Barrels mittels Immunhistochemie und Cytochromoxidase-Reaktion. A, B, C: Montagen von Ausschnittsaufnahmen von drei Serienschnitten aus dem primärsomatosensorischen Kortex. Man erkennt zwei Barrels und zahlreiche immunmarkierte Zellen, von denen manche rekonstruiert und auf den folgenden Seiten abgebildet sind (Pfeile mit Abbildungsnummern). D, E: Schematische Darstellung der beiden Barrels, nachdem sie anhand von acht Serienschnitten rekonstruiert worden sind, und die Lokalisation der Perikarya von 35 rekonstruierten VIP-Neuronen in und um diese Barrels herum. Zellen in den supragranulären () und infragranulären () Schichten sowie der Granulärschicht () sind durch unterschiedliche Symbole markiert. Manche der in dieser Arbeit abgebildeten Zellen sind durch ihre Abbildungsnummern in D gekennzeichnet. Länge der Maßstäbe: 400 µm. D: Normale Ansicht auf die Rekonstruktion. E: Die in D abgebildeten Strukturen nach Rotation, so dass der Eindruck einer Ansicht auf Tangentialschnitte entsteht.   Abb. 8: Fotografien von VIP-Zellen. A, B: Fotomontage (B) und computergestützte Rekonstruktion (A) der in Abb. 16 dargestellten fontänenartigen Zelle a, mit gleichem Vergrößerungsfaktor zum Vergleich nebeneinander gestellt. Länge des Maßstabs: 50 µm. C: Fotomontage von VIP-Fasern (Pfeilköpfe), die sich korbzellenartig um das Perikaryon einer nicht immungefärbten Zelle (Sternchen) winden. Vermutlich handelt es sich um die Axone mehrerer VIP-Neurone, die sich en passant der gleichen Nervenzelle anlegen. Länge des Maßstabs: 20 µm.   17

 

Abb. 7 18

 

Abb. 8 19

 

Zellverteilung VIP-Neurone fanden sich in allen kortikalen Schichten und in der untergelagerten weißen Substanz. Von den immunhistochemisch und durch die Cytochromoxidase-Reaktion doppelgefärbten Schnitten wurden insgesamt 1818 VIP-Zellen aus allen kortikalen Schichten kartiert. 48% davon befanden sich in den supragranulären Schichten, 16% in Schicht IV und 36% in den infragranulären Schichten (Abb. 9). Von den Zellen der Granulärschicht befanden sich 7% innerhalb der Barrels und 9% außerhalb davon in den Septa. Auch die Zelldichte, errechnet als Anzahl von VIP-Zellen innerhalb einer Fokusebene pro Quadratmillimeter Gewebefläche, war bei allen Tieren in den supragranulären Schichten am höchsten. Die Zelldichte in den supragranulären Schichten wurde daher auf 100% festgelegt. Bezogen auf die supragranulären Schichten betrug die Zelldichte in der Granulärschicht 62%. Dabei wiesen die Septa mit 75% der Zelldichte der supragranulären Schichten einen höheren Wert auf als die Barrels (51%). Die Zelldichte war am niedrigsten in den infragranulären Schichten (44%). VIP-Zellen aus den kortikalen Schichten II-VI und der weißen Substanz wurden zur Rekonstruktion ausgewählt. Die Verteilung von 35 der rekonstruierten Zellen im räumlichen Verhältnis zu zwei benachbarten Barrels ist in Abbildung 7 dargestellt.     Abb. 9: Verteilung von VIP-Zellen auf Schnitten durch den Barrel-Kortex. Exemplarisch ist anhand der Zeichnungen zweier Serienschnitte durch den Barrel-Kortex einer Ratte die Verteilung von VIP-Neuronen dargestellt. Es sind jeweils fünf Barrels in der Granulärschicht eingezeichnet. Die römischen Zahlen in der Mitte kennzeichnen die kortikalen Schichten. VIP-Neurone sind in allen kortikalen Schichten und auch in der untergelagerten weißen Substanz zu finden. Die höchste Zelldichte findet sich in den Schichten II/III.   20

 

Morphologie von VIP-Neuronen Dendriten Die Gestalt von Soma und Dendriten der VIP-Zellen im primär-somatosensorischen Kortex der Ratte entsprach in ihren Grundzügen weitgehend den Berichten aus anderen Hirnrindengebieten (siehe Einleitung). Aufgrund der somatodendritischen Morphologie wurden die folgenden VIP-Zellklassen unterschieden (Abb. 10): 1.) Bipolare, einfach gebüschelte und zweifach gebüschelte Neurone. A) Bipolare VIP-Neurone wiesen an jedem Pol des spindelförmigen Perikaryons einen Dendritenstamm auf, der ungeteilt über eine längere Strecke verlief. B) Einfach gebüschelte Neurone waren solche, deren einem Pol mindestens zwei Dendriten entsprangen, oder die einen sehr dicken und kurzen Hauptstamm besaßen, der sich somanah in mehrere Zweige teilte, während der andere Pol Ursprung eines proximal unverzweigten Dendritenstammes war. C) Zweifach gebüschelte Neurone wiesen an beiden Polen des Somas Büschel auf, wie bereits in B) beschrieben. 2.) Modifizierte bipolare und tripolare Neurone, eine heterogene Klasse von Zellen mit drei Dendriten-Hauptstämmen und manchmal konischen Perikarya, die nichtsdestoweniger typische Merkmale von bipolaren Zellen aufweisen (Details in Connor und Peters, 1984 [25]). 3.) Multipolare Neurone, mit mindestens vier primären Dendritenstämmen, an unterschiedlichen Seiten des Somas entspringend. 4.) Andere Neurone, die keiner der oben genannten Klassen zugeordnet werden können, wie z.B. manche Zellen aus den infragranulären Schichten.     In einer Stichprobe von 150 VIP-Zellen aus fünf Tieren war die Zusammensetzung wie folgt: Bipolare, einfach gebüschelte und zweifach gebüschelte Neurone stellten mit 76% den größten Anteil der Population. 14% der VIP-Zellen waren tripolare oder modifiziert-bipolare Neurone, 7% waren multipolar und 3% fielen durch Eigenschaften auf, die keiner der übrigen Zellklassen zugeordnet werden konnten. Insgesamt wiesen VIP-Zellen eine große Formenvielfalt auf, wenngleich die meisten Zellen bipolarer oder gebüschelter Art waren (Abb. 10). Aufgrund der vertikalen Orientierung ihres im Durchschnitt 750 µm langen Dendritenbaumes erstreckten sich viele VIP-Zellen mit ihren Dendriten über mehrere kortikale Schichten. Dies traf aufgrund der geringeren Dicke der Kortexschichten vor allem für die Zellen in den Laminae II-IV zu. Viele dieser VIP-Neurone besaßen ein oder zwei Dendriten, die dem apikalen Pol des Perikaryon entsprangen und weitgehend unverzweigt durch die Schichten II/III zogen, um sich dann in der Molekularschicht mehrfach dichotom aufzuzweigen. Ein auffälliges und regelmäßig auftretendes Merkmal dieser äste in Schicht I war das Vorkommen von perlschnurartig aufgereihten, großen, runden Varikositäten (Abb. 13, 14, 15, 21). Im Gegensatz dazu verzweigten sich die Dendriten, die dem der weißen Substanz zugewandten Pol der Zellen entsprangen, weiter proximal in Nähe des Somas und besaßen ein vielfältigeres Aussehen. 21

 

Obwohl auch hier dendritische Varikositäten auftraten, waren sie weitaus weniger regelmäßig geformt und auch nicht in der typischen perlschnurartigen Weise wie in Schicht I angeordnet. In seiner horizontalen Ausdehnung war der Dendritenbaum von VIP-Neuronen in den meisten Fällen begrenzt. In den Schichten, in denen sich die Dendriten aufzweigten, erreichte der Dendritenbaum in der Tangentialebene einen Durchmesser von durchschnittlich etwa 235 µm in den Schichten I-Va. Mit circa 290 µm im Mittel etwas breitere Dendritenbäume fanden sich vor allem im unteren Abschnitt der infragranulären Schichten. Da ein Dendritenstamm jedoch über größere Strecken unverzweigt verlaufen konnte, war das Einzugsgebiet der Dendriten allerdings oftmals nur in umschriebenen Bereichen derart weit, wie zum Beispiel in der Molekularschicht (Abb. 13, Zelle a). Zellen mit einer größeren horizontalen Ausdehnung der Dendriten wichen oft von dem geschilderten morphologischen Grundmuster ab, zum Beispiel dadurch, dass das Neuron zwar bipolar, aber horizontal oder schräg orientiert war (Abb. 14, Zelle b; Abb. 15, Zelle a). Einige der VIP-Neurone waren im Verlauf ihrer Dendriten locker mit Dornen (Spines) besetzt (Abb. 18, Zelle c). Eine klare Zuordnung von Spines zu bestimmten oben genannten Zelltypen konnte allerdings nicht vorgenommen werden.     Abb. 10: Die unterschiedlichen Arten von VIP-Zellen nach somato-dendritischen Gesichtspunkten. Eine schematisierte Darstellung der unterschiedlichen Formen von VIP-Neuronen, eingeteilt nach Merkmalen des Dendritenbaumes der Zellen. Die Neurone waren überwiegend bipolar (1a), einfach gebüschelt (1b) oder zweifach gebüschelt (1c). 14% der Zellen wiesen drei Dendriten auf und wurden als modifiziert bipolar oder tripolar (2) eingestuft. 7% der Zellen waren multipolar (3). Einige Zellen konnten keiner der genannten Klassen zugeordnet werden und bilden daher eine eigenständige Gruppe (4). Dazu gehören insbesondere Zellen aus den infragranulären Schichten, z.B. durch ihren somato-dendritischen Aspekt an Tintenfische erinnernde Zellen (linke Zelle).   22

 

Axone Das Axon von VIP-Neuronen entsprang meist proximal in Nähe des Somas einem der Dendritenstämme oder etwas seltener dem Perikaryon selbst. Der Verlauf des Axonhauptstammes war weit überwiegend senkrecht zur pialen Oberfläche, also vertikal orientiert (Abb. 11). Die meisten Zellen, insbesondere in den supragranulären und den infragranulären Schichten, besaßen deszendierende Axone, die tiefer gelegene Bereiche des Kortex innervierten (Abb. 14, 15, 19, 20). Aufgrund des horizontal kaum kollateralisierenden, deszendierenden Axonbaumes waren viele VIP-Zellen in den supragranulären Schichten Double-bouquet-Zellen vergleichbar (Abb. 14), wenn sie auch nicht alle dieser Zellgruppe zugewiesenen Merkmale, insbesondere der Dendriten, aufwiesen [79]. Deszendierende Axonkollateralen von VIP-Zellen näherten sich vielfach vertikal orientierten Dendriten von anderen VIP-Zellen in tieferen Schichten und bildeten mit diesen zusammen oft mehr als 100 Mikrometer lange Bündel mit vermutlich zahlreichen axodendritischen Synapsen. Dieses Phänomen war vor allem im großenteils der Schicht V entsprechenden Abschnitt der infragranulären Schichten zu beobachten. Nichtsdestoweniger besaßen etwa 30% der untersuchten Zellen primär aszendierende, zur Pia hin strebende Axone, vor allem im unteren Abschnitt der supragranulären Schichten und in der Granulärschicht sowie, wenn auch weitaus seltener, in den infragranulären Schichten (Abb. 16, 17, 19). Einige dieser Zellen in den Schichten II-IV wiesen besondere Regelmäßigkeiten in ihrer Gestalt auf, die Anlass dazu gaben, sie als einen speziellen Zelltyp aufzufassen, der bisher nicht der Population der VIP-Zellen zugeordnet worden ist. Das Perikaryon dieser Zellen befand sich entweder in Schicht IV oder im unteren Abschnitt der supragranulären Schichten und wies zwei, manchmal drei Dendritenstämme auf, die ihm entsprangen (Abb. 16). Der vom apikalen Zellpol entspringende Dendritenstamm teilte sich in einer Entfernung vom Perikaryon von nicht mehr als 100 µm dichotom, die äste folgten einem schrägen Verlauf. Das Axon hatte seinen Ursprung entweder unmittelbar an der Bifurkationsstelle oder etwas weiter proximal, stieg zunächst vertikal auf, bog dann aber am Scheitel des Axonbaumes haarnadelförmig ab, um vertikal zu deszendieren. Während dieses Verlaufes bildete der Axonstamm mehrere Kollateralen aus, die jeweils bogenlampenartig deszendierten (Abb. 11, 16). Dendriten und Axon dieser Zellen boten somit den Aspekt einer Fontäne oder einer Trauerweide, was nahelegt, diese VIP-Neurone deskriptiv als fontänen- oder trauerweidenartig (engl. fountain- oder weeping-willow-like) zu bezeichnen. Aufgrund dieses axonalen Verzweigungsmusters und der Lokalisation von Axon und Dendriten überwiegend in den Schichten III und IV scheinen diese Zellen geeignet, in Schicht IV eingehende neuronale Signale in einen in tangentialer Richtung sehr umschriebenen Bereich unmittelbar darüber weiterzuleiten (Abb. 11, 16). 23

 

Abb. 11:  Axonale Verzweigungsmuster von VIP-Zellen. Die Axone von VIP-Zellen waren entweder aszendierend oder deszendierend. Auffallende Unterschiede in der Ausprägung des Axonbaumes gab es zwischen VIP-Neuronen in den Schichten I-Va und in den Schichten Vb-VI. Erstere wiesen schmale Axonbäume auf, die die Breite des Dendritenbaumes nicht überschritten und vertikal orientiert waren. VIP-Neurone der zweiten Gruppe hingegen besaßen oftmals deszendierende Axonstämme mit langen horizontalen Kollateralen. Die VIP-Zelle links oben zeigt typische Merkmale von trauerweiden- oder fontänenartigen Neuronen (engl. Weeping-willow-like neurons). Im gesamten Barrel-Kortex bildeten VIP-Axonkollateralen gelegentlich korbartige Anlagerungen um die Zellkörper von VIP-Neuronen und oft auch um nicht angefärbte Zellkörper aus (Abb. 8). Obwohl die Axone einiger der rekonstruierten Zellen einzelnen Perikarya anderer Zellen wiederholt sehr nahe traten und dabei diese umwickelnd perisomatische Körbe ausbildeten, ist es nicht gelungen, eine umschriebene Gruppe von Korbzellen innerhalb der Population von VIP-Neuronen auszumachen. Dazu war die Anzahl der von einzelnen Axonbäumen gebildeten perisomatischen Körbe zu gering. Ebensowenig gelang es, von perisomatischen Körben ausgehend das Axon zur Ursprungszelle bis zum Initialsegment retrograd zurückzuverfolgen, obwohl das einige Male versucht worden ist. Eine mögliche Ursache hierfür ist die unvollständige Darstellung des Verlaufs der Axonkollateralen infolge ihrer Myelinisierung. 24

 

Schichtenabhängige Unterschiede zwischen den Zellen, räumliche Beziehung zu Kolumnen Einige morphologische Eigenschaften sowohl der Dendriten als auch der Axone von VIP-Neuronen im primär-somatosensorischen Kortex wiesen eine deutliche Abhängigkeit von der Lokalisation des Perikaryons innerhalb der isokortikalen Schichten auf. Aufgrund dessen wurden zwei heterogene Gruppen von VIP-Neuronen mit unterschiedlichen Lokalisationen oberhalb und unterhalb einer unscharfen, durch die Schicht V gezogenen horizontal verlaufenden Linie differenziert. Hinsichtlich der Ausdehnung des Dendritenbaumes in der Tangentialebene verhielten sich beide Gruppen gleich. Der Dendritenbaum von VIP-Zellen war in allen Schichten des Isokortex bis auf wenige Ausnahmen schmal. Unterschiede hingegen fanden sich in den laminären Bereichen, die von den Dendriten der Zellen aus beiden Gruppen erfasst wurden. VIP-Neurone in den supragranulären und der granulären Schichten wiesen sehr oft Dendriten auf, die bis in die Molekularschicht aufstiegen, sich dort aufzweigten und die bereits erwähnten perlenartigen Varikositäten ausbildeten (Abb. 13-15, 17). In der Tiefe erstreckten sich die Dendriten dieser Neurone bis in Schicht V hinein. Zellen aus dem oberen Teil der infragranulären Schichten, etwa der Schicht Va entsprechend, erreichten die Granulärschicht und endeten meist auch dort (Abb. 18, 19). VIP-Neurone aus dem Bereich unterhalb der Lamina Va hingegen erstreckten sich mit ihren Dendriten niemals bis in die Granulärschicht, sondern endeten entweder an der Schicht IV-V-Grenze oder darunter (Abb. 19, 20). Auch die Axone von VIP-Zellen in beiden Gruppen verhielten sich unterschiedlich. Die der ersten Gruppe zugehörigen Zellen, also Zellen in den Laminae II-Va, besaßen einen schmalen, vertikal orientierten Axonbaum mit einem mittleren Durchmesser von etwa 200 µm (Abb. 13-18). Nur sehr wenige dieser Zellen hatten ein Axon mit einer horizontalen Ausdehnung von mehr als 400 µm. Das Axon blieb in der horizontalen Ebene weitgehend beschränkt auf den von den Dendriten umfassten zylindrischen Gewebsabschnitt. Die weitaus meisten dieser Zellen hatten daher auch Axonbäume, deren horizontale Ausdehnung kleiner war als die Breite der Barrels. Entsprechend verblieben 85% der in den Schichten I-IV rekonstruierten Neurone entweder innerhalb einer Barrel-Kolumne oder außerhalb davon im Barrel-Septum oder dem Gewebe darüber oder darunter. Einige der rekonstruierten Zellen, die sich in der Peripherie einer Barrel-Kolumne befanden, wiesen eine markante Asymmetrie des Axonbaumes auf insofern, als sich das Axon von den seitlichen Barrel-Grenzen weg zum Zentrum des Barrels hin orientierte (Abb. 13, Zelle c). Andererseits gab es auch VIP-Zellen in den genannten Schichten, die diese Grenzen offensichtlich nicht respektierten (Abb. 15, Zelle b). Die Axone solcher Zellen erstreckten sich allerdings niemals über die unmittelbar benachbarte Barrel-Kolumne hinaus. Somit fielen die Zellen der ersten Gruppe, mit einer Lokalisation des Perikaryons innerhalb der Schichten I-Vb, auf durch die Tendenz, auf das Kompartiment, in dem sich das Perikaryon befand, beschränkt zu sein, also entweder auf eine Barrel-Kolumne oder auf den Septum-assoziierten Bereich zwischen den Barrel-Kolumnen. Unterschiede zwischen Zellen, die sich in den Barrels, und solchen, die sich in den Septa befanden, konnten mit Bezug auf ihre Zellfortsätze nicht beobachtet werden. Im Gegensatz dazu besaßen VIP-Zellen der zweiten Gruppe, deren Perikarya in den Schichten Vb und VI lagen, oft weit ausladende Axonbäume mit einem mittleren horizontalen Durchmesser von 550 µm (Abb. 19, 20). Eine der rekonstruierten Zellen wies sogar horizontale 25

 

Axonkollateralen mit einer Länge von mehr als 800 µm auf, die sich über drei Barrel-Kolumnen erstreckten (Abb. 20, Zelle c). Eine besondere Orientierung der horizontalen äste mit Bezug auf Barrel-Reihen oder -Bögen, wie von intrinsischen Fasern des Barrel-Kortex bekannt [14], war aus dem vorliegenden Material nicht ersichtlich. Lediglich 46% der Neurone in dieser Gruppe blieben in der Ausdehnung ihrer Fortsätze auf den kolumnären Bereich beschränkt, innerhalb dessen das Soma der Zellen lag. 54% der Zellen hingegen überschritten die seitlichen Grenzen der Barrel-Kolumnen. Es ist an dieser Stelle zu betonen, dass Axone mit einem derart ausgedehnten horizontalen Verlauf nur in den Schichten Vb und VI angetroffen wurden, dass andererseits aber auch in diesen Schichten Zellen vorlagen, deren Axonbaum schmächtig und horizontal sehr begrenzt war. Die zahlenmäßige Verteilung von VIP-Neuronen mit unterschiedlichen Durchmessern des Axonbaumes auf die supragranulären, die granuläre sowie die zwei Abschnitte der infragranulären Schichten ist in Abbildung 12 zusammengefasst.     Abb. 12: Die Verteilung von Zellen mit Axonbäumen unterschiedlichen Durchmessers auf die isokortikalen Schichten. Das Diagramm zeigt die Verteilung von 46 Zellen mit unterschiedlichen Durchmessern des Axonbaumes. Neurone mit einem Durchmesser des Axonbaumes von mehr als 500 µm werden ausschließlich im unteren Abschnitt der infragranulären Schichten, etwa den Schichten Vb und VI entsprechend, angetroffen.   26

 

Abb. 13: VIP-Neurone der supragranulären Schichten (1). Dargestellt sind ein bipolares Neuron (a), ein einfach gebüscheltes Neuron (b) und ein modifiziert bipolares Neuron (c), dessen basal entspringender Dendritenstamm sich ebenfalls proximal büschelartig verzweigt. Gemeinsames Charakteristikum aller drei Zellen sind die nach Schicht I aufsteigenden und sich dort dichotom verzweigenden Dendriten mit den sich perlschnurartig aufreihenden Varikositäten. Perikarya und Dendriten sind schraffiert, Axone mit durchgehenden schwarzen Linien dargestellt. Das Axoninitialsegment ist jeweils mit einem Pfeil markiert. Die jeweilige Lage der Schicht-I/II-Grenze ist angezeigt. Länge des Maßstabs in Teilbild A: 200 µm. Die Teilbilder B und C geben einen Ausschnitt aus dem primär-somatosensorischen Kortex wieder mit zwei Barrels und der genauen Lage der Zellen zu diesen Barrels. Länge des Maßstabs in B und C: 400 µm. Zu Zelle a: Das Axon entspringt direkt dem Soma und hat einen initial aszendierenden Verlauf. Vor Erreichen der Grenze zwischen den Schichten I und II biegt es ab; seine Kollateralen schlagen eine schräg deszendierende Richtung ein. Zu Zelle b: Neben dem vom apikalen Pol der Zelle entspringenden Dendritenstamm nehmen auch zwei Kollateralen des vom unteren Pol der Zelle entspringenden Dendritenstammes einen nach Schicht I aszendierenden Verlauf. Das Axon hat seinen Ursprung an einem der Dendriten und steigt in das Barrel hinab, wo es sich verzweigt. Zu Zelle c: Auffälliges Merkmal dieser Zelle ist das Axon, das an einem der unteren Dendritenzweige entspringt und im Verhältnis zum Dendritenbaum stark nach rechts lateralisiert. Als Ergebnis dieser Asymmetrie bleibt das Axon der in der Peripherie der Barrel-Kolumne gelegenen Zelle auf diese Barrel-Kolumne beschränkt.   Abb. 14: VIP-Neurone der supragranulären Schichten (2). Dargestellt sind drei Neurone mit einigen morphologischen Eigenschaften von Double-bouquet-Zellen. Obwohl der somatodendritische Aspekt nicht wirklich streng dem von zweifach gebüschelten Zellen entspricht, wie der Name Double-bouquet erwarten lässt, zeigt das Axon dennoch einen für Double-bouquet-Zellen postulierten, senkrecht deszendierenden Verlauf mit geringem horizontalen Durchmesser des Axonbaums. Länge aller Maßstäbe: 400 µm. Zu Zelle a: Das Axon entspringt direkt dem Perikaryon und steigt zunächst in schräger Richtung auf. Anschließend teilt es sich in einen sich büschelartig aufzweigenden oberen und in einen senkrecht absteigenden unteren Abschnitt auf. Zu Zelle b: Eine einseitig gebüschelte Zelle mit auffälligem, schräg orientiertem Dendritenbaum und einem für Double-bouquet-Zellen typischen Axonbaum. Zu Zelle c: Eine bipolare Zelle, wiederum mit einem für Double-bouquet-Zellen typischem Axonbaum.   27

 

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Abb. 15: VIP-Neurone der supragranulären Schichten (3). Dargestellt sind zwei Nervenzellen, die trotz einiger typischer Eigenschaften von VIP-Neuronen in den supragranulären Schichten (siehe Abb. 13 und 14) in unterschiedlicher Weise aus dem Rahmen fallen. Perikarya und Dendriten sind schraffiert, Axone mit durchgehenden schwarzen Linien dargestellt. Das Axoninitialsegment ist jeweils mit einem Pfeil markiert. Die Schicht-I/II-Grenze ist angezeigt. Länge des Maßstabs in Teilbild A: 200 µm. Die Teilbilder B und C geben einen Ausschnitt aus dem primär-somatosensorischen Kortex wieder mit zwei Barrels und der genauen Lage der Zellen zu diesen Barrels. Länge des Maßstabs in B und C: 400 µm. Zu Zelle a: Obwohl es sich um eine zweifach gebüschelte Zelle handelt, strahlen die Dendriten sternförmig vom Soma weg, so dass auf den ersten Blick der Eindruck einer multipolaren Zelle entsteht. Nichtdestoweniger ist auch hier der Axonbaum säulenähnlich gestaltet und vertikal orientiert. Zu Zelle b: Eine modifiziert bipolare, in einer Septum-assoziierten Kolumne gelegene Zelle. Der breite Dendritenbaum und das in ähnlichem Maß weit ausladende Axon sind sicher nicht auf die Kolumne, in der sich das Perikaryon befindet, beschränkt.   Abb. 16: Weeping-willow-artige Nervenzellen. Zwei Neuronen aus Schicht IV mit fontänen- oder trauerweidenartiger Gestalt des am oberen Zellpol entspringenden Dendritenstammes und des Axons. Der Dendritenstamm teilt sich nach kurzem Verlauf in mehrere, schräg verlaufende Äste. Das Axon entspringt in der Nähe der Teilungsstelle und aszendiert zunächst, um dann aber haarnadelförmig wieder abzusteigen. In seinem Verlauf gibt es bogenförmige Kollateralen ab. Maßstab in Teilbild A: 200 µm. Maßstab in Teilbild B: 400 µm.   32

 

Abb. 17: VIP-Neurone der Granulärschicht (2). Zwei weitere Nervenzellen der Granulärschicht. Maßstab in A: 200 µm. Maßstab in B: 400 µm. Zu Zelle a: Eine modifiziert bipolare Zelle mit Eigenschaften von weeping-willow- oder fontänenartigen VIP-Neuronen. Das Axon hat seinen Ursprung erneut in unmittelbarer Nähe der Hauptteilungsstelle des oberen Dendritenstammes (siehe auch Abb. 16). Zu Zelle b: Eine typische bipolare Zelle, deren Dendriten von Schicht I nach Schicht V reichen. Trotz seiner Länge ist das Axon der Zelle schmächtig und kaum verzweigt. Inwieweit dieses Verzweigungsmuster typisch ist für diese Zellen, und inwieweit ihm technische Widrigkeiten zu Grunde liegen, lässt sich nicht sicher beantworten. Auf jeden Fall ließ sich bei keiner dieser Zellen ein wesentlich komplexerer Axonbaum darstellen.   Abb. 18: VIP-Neurone der Schichten IV und Va. Alle drei Nervenzellen sind gekennzeichnet durch einen schmalen Axonbaum. Maßstäbe in A und B: 200 µm. Zu Zelle a: Eine bipolare Zelle in Schicht Va. Der obere Dendritenstamm reicht bis in Schicht IV und verzweigt sich dort. Typischerweise erreicht er nicht die darüberliegenden Schichten. Zu Zelle b: Die einfach gebüschelte Zelle ist in Schicht IV nahe der Schicht-V-Grenze lokalisiert. Der am oberen Pol der Zelle entspringende Dendrit reicht bis nach Schicht I. Am Axonbaum fällt eine horizontale Kollaterale auf. Nichtsdestoweniger beträgt die Breite des Axonbaums nicht mehr als 300 µm. Zu Zelle c: Eine doppelt gebüschelte Zelle aus Schicht IV. Das Axon reicht kaum über den Einzugsbereich der Dendriten hinaus.   33

 

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Abb. 19: VIP-Neurone der infragranulären Schichten (1). Vier Neurone der infragranulären Schichten, zwei aus dem oberen Anteil (a und b), zwei aus dem unteren Anteil (c und d). Maßstäbe in den Teilbildern A und B: 400 µm. Zu Zelle a: Eine zweifach gebüschelte Zelle, deren Perikaryon dicht unter der Schicht IV-V-Grenze liegt. Die Zweige der oberen Dendriten reichen nicht über das Barrel hinaus. Der Axonbaum ist schmal und kollateralisiert kaum in horizontaler Richtung. Er ist auf eine Barrel-Kolumne begrenzt. Zu Zelle b: ähnlich den weeping-willow-artigen Zellen entspringt das Axon aus der Gabelungsstelle des oberen Dendritenstammes und aszendiert. In pialer Richtung konnte es leider nicht vollständig rekonstruiert werden, so dass der gesamte Einzugsbereich des Axons im Dunkeln bleibt. Es könnte sich aber um eine Martinotti-Zelle handeln. Zu Zelle c: Ein auf Schicht VI beschränktes Neuron, das aufgrund der geringen Höhe des Dendritenbaumes und der weiten, horizontalen Axonkollateralen eine deutliche tangentiale Orientierung aufweist. Auffällig ist der kerzenartig aszendierende Axonausläufer, der von einer der horizontalen Kollateralen abzweigt. Zu Zelle d: Eine weitere Zelle aus Schicht VI, ebenfalls durch horizontale sowie einzelne, aszendierende Axonkollateralen gekennzeichnet.   Abb. 20: VIP-Neurone der infragranulären Schichten (2). Die Zellen a, b und c sind in Schicht VI lokalisiert, das Neuron d entstammt der dem Barrel-Kortex untergelagerten weißen Substanz. Maßstab in A: 200 µm. Maßstab in B: 400 µm. Zu Zelle a: Ein zweifach gebüscheltes VIP-Neuron, deren Gestalt, wie oft in Schicht VI beobachtet, von den üblichen Mustern abweicht. So entspringt dem oberen Pol des Somas lediglich das horizontal weit kollateralisierende Axon, während der eigentlich hier zu erwartende Dendritenstamm der Seite des Somas entspringt. Die Zelle ist nicht in B eingezeichnet, sie entstammt einem Hirnschnitt, der keiner Cytochromoxidase-Reaktion ausgesetzt worden war. Zu Zelle b: Mit ihren drei an der Oberseite des Somas entspringenden Dendriten ähnelt dieses Neuron einem hinabtauchenden Tintenfisch. Das gerade Axon zeigt fast keine Kollateralen. Zu Zelle c: Eine bipolare Zelle mit langen horizontalen Axonkollateralen von über 800 µm Länge. Wie bei den Zellen c und d in Abb. 19 fallen auch hier vertikal aszendierende Axonzweige an den horizontalen Kollateralen auf. Zu Zelle d: Eine in der weißen Substanz lokalisierte VIP-Zelle. Abschnitte des medial entspringenden Dendriten reichen noch nach Schicht VI des darübergelagerten Barrel-Kortex hinein. Das Axon ließ sich aufgrund der großen Dichte von ungefärbten Fasern in diesem Bereich kaum rekonstruieren. Die Grenzen zum Barrel-Kortex (oben) und zum Striatum (unten) sind durch gestrichtelte Linien dargestellt.   38

 

Abb. 21: VIP-Neurone aus dem frontalen Kortex der Ratte. Es handelt sich um eine einfach gebüschelte Zelle aus Schicht V (a) und um eine Double-bouquet-Zelle aus Schicht II/III (b) des primär-motorischen Kortex der Ratte, mit Biocytin in vitro gefüllt und freundlich zur Rekonstruktion überlassen von Porter und Mitarbeitern (veröffentlicht in Porter et al., 1998 [71]). Auffällig ist der große Reichtum an axonalen Verzweigungen, der mit dieser Technik sichtbar gemacht werden kann. Die Grenzen zwischen den einzelnen Schichten sind markiert. Länge des Maßstabs: 400 µm. Zu Zelle a: Im Gegensatz zu allen im primär-somatosensorischen Kortex rekonstruierten Schicht-V-Neuronen besitzt diese Nervenzelle einen vom oberen Pol des Somas entspringenden Dendriten, der bis in die Molekularschicht reicht. Der Axonbaum weist zahlreiche horizontale Kollateralen auf und hat einen tangentialen Durchmesser von über 400 µm. Zu Zelle b: Das bestimmende Merkmal dieser Double-bouquet-Zelle ist das schweifartig bis in die Schicht VI hinabreichende Axon.   39

 

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Diskussion:   Kritische Beurteilung der angewandten Methodik Die in dieser Arbeit vorgestellten VIP-Neurone aus dem primär-somatosensorischen Kortex der Ratte wurden mit Hilfe von immunhistochemischen Methoden sichtbar gemacht und an einem Computermikroskop rekonstruiert. Die abgebildeten Zellrekonstruktionen zeigen, dass neben dem kompletten Dendritenbaum auch das Axon der VIP-Neurone hinreichend dargestellt wurde, um aufgrund dessen eine zuverlässige Klassifikation der Zellen zu gewährleisten. Trotzdem wird eine Schwäche dieses Versuchsprotokolls deutlich durch den Vergleich mit Neuronen aus dem frontalen Kortex der Ratte [43,71], die aufgrund elektrophysiologischer Merkmale identifiziert und mit Biocytin intrazellulär gefüllt und dargestellt worden sind. Rekonstruktionen solcher Zellen zeigen einen deutlich dichteren Axonbaum, der den Eindruck größerer Vollständigkeit erweckt (Abb. 21). Allerdings ist es kaum möglich, mit dieser aufwendigen Methode eine größere Anzahl von Zellen unselektiv darzustellen. Der für die vorliegende Arbeit angewandte immunhistochemische Ansatz hingegen stellt die weitaus meisten, wenn nicht alle in einem Schnitt enthaltenen VIP-Zellen dar und ist somit für einen umfassenden Bericht über VIP-Neurone in diesem Kortexabschnitt gut geeignet. Es bleibt allerdings anzumerken, dass auch beim immunhistochemischen Ansatz eine gewisse Selektion der darzustellenden Zellen insofern erfolgen muss, als es in der Praxis nicht möglich ist, alle angefärbten Zellen zu rekonstruieren. Um die VIP-Zellen innerhalb der geschilderten Grenzen möglichst vollständig rekonstruieren zu können, war es erforderlich, die Fortsetzungen von an der Schnittebene durchtrennten, bereits teilweise rekonstruierten Zellstrukturen im Folgeschnitt weiterzuverfolgen. Daher konnten aufeinander folgende Schnitte einer Serie nur immunhistochemisch und nicht mit der Nissl-Technik, die eine klare Differenzierung der kortikalen Schichten gestattet, angefärbt werden. Eine absolut genaue Abgrenzung der einzelnen Kortexschichten war deshalb bei dieser Untersuchung nicht möglich. Anhand der Darstellung der Barrels durch Cytochromoxidase-Histochemie konnte die Laminierung der Hirnrinde grob nachvollzogen werden. Allerdings ist fraglich, ob die Höhe der Barrels mit der Dicke der Schicht IV tatsächlich übereinstimmt. In der Literatur liegen Angaben vor, denen zufolge die durch Cytochromoxidase-Histochemie dargestellten Barrels auch Zellen aus den tieferen Bereichen der Schicht III umfassen [52]. Folglich ist die Dicke der Lamina IV innerhalb dieser Studie wahrscheinlich überschätzt worden, während die supragranulären Schichten als zu dünn eingeschätzt worden sind. Da aber keine wesentlichen Unterschiede zwischen Zellen in der Granulärschicht und den supragranulären Schichten deutlich geworden sind, bleibt die Feststellung der geschilderten Problematik für die vorliegende Studie ohne praktische Relevanz. Ein weiteres Problem stellt der Umstand dar, dass die VIP-Neurone für diese Studie von Koronarschnitten oder anderen, Koronarschnitten ähnlichen Hirnschnitten rekonstruiert worden sind, die die gesamte Dicke des Kortex erfassen. Theoretisch wären Tangentialschnitte durch den Barrel-Kortex, die das honigwabenähnliche Muster der Barrels wiedergeben, vermutlich besser geeignet gewesen, um das räumliche Verhältnis von VIP-Neuronen zu den Barrels in der Tangentialebene zu beurteilen. In der Praxis jedoch hat sich die hier geschilderte Schnitt- 41

 

führung vor allem aus zwei Gründen bewährt. Zum einen wären wesentlich mehr Serienschnitte erforderlich gewesen, um einzelne Zellen zu rekonstruieren, da diese sich in vertikaler Richtung viel weiter erstrecken als in tangentialer Richtung. Je höher allerdings die Anzahl der für eine Zellrekonstruktion erforderlichen Serienschnitte ist, umso höher ist die Gefahr, dass das Gewebe bei der histologischen Aufbereitung Schaden nimmt und durch den Verlust eines Schnittes größere Abschnitte der Zelle nicht mehr rekonstruiert werden können. Zum anderen wäre die Schichtengliederung des Kortex schlechter beurteilbar gewesen. Bei der vorliegenden Schnittführung hingegen war sowohl die Lage der VIP-Neurone in der Tiefe des Kortex als auch das räumliche Verhältnis der Zellen zu wenigstens zwei Seiten der Barrels zuverlässig darstellbar.   Die Morphologie von VIP-Neuronen Die Population der VIP-Neurone im Barrel-Kortex bestand vorwiegend aus bipolaren und tripolaren, d.h. modifiziert bipolaren Zellen mit einer ausgeprägt vertikalen Orientierung der Dendriten. Die Dendriten der Zellen in den Schichten I-IV erstreckten sich meist bis zur Molekularschicht, während die Dendriten der Zellen in den infragranulären Schichten nicht bis zur Lamina II/III reichten. In dieser Hinsicht unterschieden sich die VIP-Neurone im primär-somatosensorischen Kortex von denen im frontalen Kortex der Ratte [71] (Abb. 21, Zelle a). Die von Morrison et al. [62] beschriebenen, typisch bipolaren Neurone mit zwei langen Dendriten, die in vertikaler Richtung weite Strecken unverzweigt überbrückten und sich erst weit distal endnah aufzweigten (Abb. 17, Zelle b), wurden im Verhältnis relativ selten angetroffen, dann vor allem in Lamina V und den supragranulären Schichten. Viele VIP-Zellen in den supragranulären Schichten, aber auch in Schicht IV, besaßen Axone, die in einer ähnlichen Weise in die darunter liegenden Schichten zogen, wie es von VIP-immunreaktiven Double-Bouquet-Zellen aus dem frontalen Kortex der Ratte bekannt ist [43] (Abb. 14, 21). Ausläufer solcher Axone zeigten in unterschiedlichen Schichten einen parallelen Verlauf zu den Dendriten anderer VIP-Neurone, denen sie sich auch über längere Strecken anlegten. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass die Aktivität von VIP-Zellen innerhalb der gleichen funktionellen Kolumne weitergeleitet wird, und ist kohärent zum schlanken Erscheinungsbild der Dendriten und Axone der Zellen in diesen Schichten. VIP-Zellen zeigten keine weitergehenden morphologischen Eigenschaften von Korbzellen (vergl. [33,42,47]). Es konnten zwar in unterschiedlichen Bereichen des Barrel-Kortex wiederholt perisomatische Anlagerungen von VIP-Axonkollateralen nebst Varikositäten im Sinne eines lockeren, korbartigen Geflechts um nicht angefärbte, VIP-negative Perikarya beobachtet werden (Abb. 8), wie sie auch schon im Frontalkortex der Ratte [44], dem visuellen Kortex der Katze [91] und dem prefrontalen Primatenkortex [34] beschrieben worden sind. Allerdings gelang es nicht, ausgehend von solchen perisomatischen Körben die beteiligten Axonkollateralen retrograd bis zum Axoninitialsegment zurückzuverfolgen. Die rekonstruierten VIP-Zellen bildeten nur gelegentlich einzelne Körbe aus, ohne dabei typische Eigenschaften von Korbzellen wie zum Beispiel ein multipolares Soma und insbesondere einen horizontal weiter ausgedehnten Axonbaum aufzuweisen [33,42,47]. Es ist daher anzunehmen, dass die beobachteten perisomatischen Anlagerungen von VIP-Varikositäten in den meisten Fällen eher der akzidentellen Annäherung von Axonen mehrerer VIP-Zellen en passant um das gleiche, nicht 42

 

angefärbte Perikaryon entsprechen, ohne dass es sich dabei tatsächlich um Körbe von Korbzellen handelt.   Räumliches Verhältnis der Zellen zu den Barrels Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des räumlichen Verhältnisses von VIP-Zellen zu den Barrels. Im Vordergrund stand die Frage, inwieweit die Nähe der Barrels sich auf die Gestalt von VIP-Zellen auszuwirken scheint, eine Frage, die sich in ähnlicher, aber allgemeinerer Form schon anderen Autoren gestellt hat. Woolsey und Mitarbeiter [99] wiesen für 85% der auf Tangentialschnitten durch den Barrel-Kortex untersuchten Schicht-IV-Zellen eine Restriktion der Dendriten auf das Barrel nach, in dem sich das Soma der Zellen befand. Dabei wiesen sie auf Fälle hin, in denen sich die Dendriten von in der Peripherie eines Barrels gelegenen Neuronen auf auffällige Weise von der Barrel-Grenze weg zum Zentrum wandten, ohne die Grenze zu überschreiten. Barrel-Zellen in Mäusen, deren Vibrissenfollikel bei der Geburt lädiert worden waren, wiesen der Läsion entsprechende Anpassungen dieses Schemas auf [86]. Wenngleich Elston et al. [29] keine eindeutigen Hinweise für eine Restriktion der Dendriten von Schicht-IV-Zellen auf bestimmte Barrels fanden, erscheint es dennoch wahrscheinlich, dass diese in einem nicht näher zu beziffernden Ausmaß existiert. Darüber hinaus befanden Harris und Woolsey [40], dass eine Restriktion in genannter Weise auch für die Axone von Zellen innerhalb von Barrels zutrifft. In jüngerer Zeit war auf die ungleichmäßige Verteilung von GABA-immunreaktiven, inhibitorischen Interneuronen innerhalb des PMBSF der Maus hingewiesen worden [24], und auch VIP-immunreaktive Strukturen fanden sich spezifisch in der Peripherie von Mäuse-Barrels in größerer Zahl als im Barrel-Zentrum [104]. ähnliche Daten vom Barrel-Kortex der Ratte lagen in der Literatur bislang nicht vor. Die hier vorliegenden Einzelzellrekonstruktionen von VIP-Neuronen sind in ihrer Aussagekraft hinsichtlich der oben formulierten Fragestellung leider nicht eindeutig. VIP-Zellen in den Schichten I-Va sind gekennzeichnet durch ein in der Horizontalebene sehr schmales axonales und dendritisches Einzugsgebiet. Allein aufgrund dessen muss das VIP-Neuron in den meisten Fällen auf das entsprechende Kompartiment innerhalb oder außerhalb einer Barrel-Kolumne beschränkt bleiben. Innerhalb dieser Schichten stellt die Lokalisation des Perikaryons somit einen guten Indikator für den Einzugsbereich der Zellfortsätze dar. Eine Asymmetrie der Dendriten aufgrund der Nähe zu den Barrel-Grenzen in der im obigen Absatz geschilderten Weise konnte nicht nachgewiesen werden. Dazu waren die Dendriten zu streng vertikal orientiert und verzweigten sich zu selten. Gelegentlich fielen allerdings Asymmetrien des Axonbaumes bei Zellen auf, die sich in der Nähe der vertikalen Grenzen einer Barrel-Kolumne befanden, und deren Axonkollateralen sich von dieser Grenze weg orientierten (Abb. 13, Zelle c). Nichtsdestoweniger wiesen 15% der in den Schichten I-Va rekonstruierten Zellen ein Axon auf, dessen äste sich auf unspezifische Weise sowohl innerhalb einer Barrel-Kolumne als auch in den Septum-assoziierten Bereichen verzweigten. Für die Schichten I-Va geltend lässt sich daher eine Tendenz von VIP-Neuronen feststellen, sich innerhalb der Kolumne, in der sich das Perikaryon befindet, aufzuzweigen und auch zu verbleiben. Ob dieses Muster allerdings kausal auf das Vorhandensein von Barrels in diesem Kortexabschnitt zurückzuführen ist, wird sich auf diese Weise nicht abschließend beantworten lassen. Aufschluss darüber kann man sich von einer vergleichenden Untersuchung der VIP-Neurone in Ratten 43

 

mit experimentell alteriertem Barrel-Feld oder vielleicht auch in der Mausmutante "Barrelless" [94], bei der keine Barrels ausgebildet werden, erhoffen. Während für VIP-Neurone in den Schichten I-Va eine relative Beschränktheit auf eines der zwei Hauptkompartimente im Barrel-Kortex bestätigt werden kann, ist das Gegenteil der Fall für die Zellen in den darunterliegenden Schichten. Wenngleich die Ausdehnung von Soma und Dendritenbaum nicht wesentlich unterschiedlich ist von den darüberliegenden Zellen, ist der Axonbaum hier gekennzeichnet durch zum Teil weitreichende horizontale Axonkollateralen. Aufgrund dieses Merkmals überschreitet mehr als die Hälfte dieser Zellen mit ihrem Axon die seitlichen Grenzen einer Barrel-Kolumne. Es stellt sich die Frage nach dem Grund für diesen auffälligen, schichtengebundenen Unterschied zwischen VIP-Neuronen der einen und der anderen Gruppe, und mindestens zwei mögliche Antworten bieten sich an. Ein erster möglicher Grund kann darin bestehen, dass die Population von VIP-immunreaktiven Zellen an sich nicht homogen ist, sondern sich in mehrere Subpopulationen mit unterschiedlichen Merkmalen und Funktionen weiter aufteilen lässt. Für eine solche Heterogenität lassen sich neben den genannten morphologischen Differenzen auch 1.) Unterschiede hinsichtlich der Synthese von Neurotransmittern und Kalzium-bindenden Proteinen sowie 2.) unterschiedliche elektrophysiologische Verhaltensweisen der Zellen anführen: Ad 1.) Es hat sich herausgestellt, dass zwar alle VIP-Neurone auch immunreaktiv sind für GABA oder das GABA bildende Enzym Glutamatdecarboxylase (GAD) [10,44,71], sich aber nur in einem Drittel der VIP-Zellen zugleich das Acetylcholin bildende Enzym Cholin-Acetyltransferase (ChAT) nachweisen lässt [10,20]. Frühere Berichte von einer weitergehenden überlappung der cholinergen und VIP-immunreaktiven Zellpopulationen [28] konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden [10]. Darüberhinaus ist eine nur partielle Kolokalisation von VIP und dem Kalzium-bindenden Protein Calretinin und von VIP mit dem Neuropeptid Cholezystokinin berichtet worden [44,50,74]. Von möglicher Relevanz ist die Feststellung, dass der Grad der Kolokalisation von VIP und Calretinin schichtenabhängig war insofern, als mehr VIP-Zellen in den infragranulären Schichten auch Calretinin enthielten als in den Schichten I-IV [74]. Ad 2.) Die Population von VIP-immunreaktiven Zellen im Frontalkortex der Ratte lässt sich intrazellulären, elektrophysiologischen Ableitungen zufolge in zwei Gruppen aufteilen, in regelmäßig entladende (regular-spiking, RSNP) und in unregelmäßig entladende (irregular-spiking, burst-firing, IS) Zellen [17,44]. Nach Porter und Mitarbeitern [71] besteht die Gruppe der unregelmäßig entladenden Zellen ausschließlich aus VIP synthetisierenden Zellen, so dass diese Form der Entladung als Merkmal zur elektrophysiologischen Identifizierung von VIP-Zellen herangezogen werden kann. Die Gruppe der IS lässt sich noch weiter unterteilen auf der Grundlage der initialen Entladungsform und ferner aufgrund der Kolokalisation der Stoffe Calretinin und Acetylcholin. Porter et al. berichteten ferner, dass neurochemische Unterschiede wie das Vorhandensein oder Fehlen einer Kolokalisation von VIP mit einem dieser beiden Stoffe mit einer unterschiedlichen Dauer der initial salvenartigen Entladung der Zellen nach experimenteller Depolarisation einhergehen. In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, dass die Kolokalisation von VIP und Cholin-Acetyltransferase   44

 

schichtenspezifisch ungleich verteilt ist, mit einer weitgehend fehlenden Kolokalisation der beiden Stoffe in den VIP-Zellen der supragranulären Schichten (Tabelle 1, entnommen aus Bayraktar et al., 1997 [10]). Da dieser Umstand somit auch mit einer ungleichmäßigen Verteilung von elektrophysiologisch unterscheidbaren Neuronen über die kortikalen Schichten korrelieren muss, stellt sich die Frage nach einer funk-tionellen Relevanz dieser Beobachtung. Eine Korrelation zwischen den angeführten, in die Literatur eingegangenen Berichten über die verschiedenen Gruppen von VIP-Neuronen einerseits und der hier vorgestellten Differenzierung von VIP-Neuronen aufgrund schichtenabhängiger, morphologischer Unterschiede andererseits bleibt allerdings aufzuzeigen.     Par 1 Par 2 HL FL Alle untersuch- ten Areale   I - (0%) 2 (100%) 1 - - - - - 1 (33%) 2 (67%) II / III 1 (4%) 23 (96%) 1 (17%) 5 (83%) 4 (57%) 3 (43%) - (0%) 4 (100%) 6 (15%) 35 (85%) IV 6 (43%) 8 (57%) 1 - 1 1 1 1 9 (47%) 10 (53%) V 10 (50%) 10 (50%) - 3 - 1 - - 10 (42%) 14 (58%) VI 5 (50%) 5 (50%) 1 1 - - 1 1 7 (50%) 7 (50%) ML 1 (100%) - (0%) - - - - 1 - 2 (100%) 0 (0%)                   35 (34%) 68 (66%)   Tabelle 1: Kolokalisation von VIP und Cholin-Acetyltransferase (ChAT) im Isokortex der Ratte. Die meisten Zellen wurden im primär-somatosensorischen Kortex untersucht. ( bedeutet Kolokalisation, ( bedeutet fehlende Kolokalisation. Die römischen Zahlen in der ersten Spalte bezeichnen die kortikalen Schichten (ML = Marklager). Die Prozentzahlen in Klammern geben die relative Menge kolokalisierender bzw. nicht kolokalisierender Neurone an. Par1 = primär-somatosensorischer Kortex. Par2 = somatosensorischer Kortex, Areal 2. FL = sensomotorisches Hirnareal der vorderen Extremität. HL = sensomotorisches Hirnareal der hinteren Extremität. Daten entnommen aus Bayraktar et al., 1997 [10]. 45

 

	Der Hypothese einer an sich bestehenden Heterogenität der VIP-Zellpopulation mit einer Beteiligung der Zellmorphe steht ein weiterer Erklärungsansatz entgegen. Zahlreiche Publikationen wiesen auf Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften der isokortikalen Schichten und der in ihnen enthaltenen Neurone hin. Aus dem kontralateralen Vibrissenfeld kommende, in den Kerngebieten des Nervus trigeminus und des Thalamus umgeschaltete, spezifische thalamokortikale Afferenzen enden im Barrel-Kortex überwiegend in somatotoper Ordnung in den Barrels in Schicht IV, in geringer geordneter Weise auch an der Grenze der Schichten V und VI [2,84,85,94]. Ausgehend von der Granulärschicht breitet sich die auf die Reizung einer bestimmten Vibrisse folgende Erregung zunächst in die supragranulären Schichten und dann in die infragranulären Schichten aus [7,83,90,95]. Auch eine unmittelbare Erregungsleitung aus der Granulärschicht in die infragranulären Schichten existiert [90] und macht sich durch vergleichsweise geringe Latenzen der dortigen Neuronen auf somatosensorische Stimuli bemerkbar [16]. Inwieweit die die Schicht IV durchziehenden apikalen Dendriten der untersuchten Zellen sowie die Terminalen von thalamokortikalen Axonen an der Schicht-V/VI-Grenze zu diesen Latenzen beitragen, muss an dieser Stelle aufgrund fehlender Daten offen gelassen werden. Auf ihrem Weg werden die zunächst einfachen, spezifischen Informationen modifiziert und mit Informationen von benachbarten Vibrissen und aus anderen Bereichen des ZNS integriert. Dies lässt sich zum einen durch physiologische Untersuchungen [19,77], zum anderen durch anatomische Darstellungen der intrakortikalen Faserverbindungen in den einzelnen Schichten [14,32,49,82,90,101] erkennen. Letztere haben wiederholt die im Verhältnis geringe Ausbildung von horizontalen Fasern innerhalb der Granulärschicht aufgezeigt [14,82]. Für die übrigen Schichten wurde eine ausgeprägte Interkonnektivität zwischen mehreren Barrel-Kolumnen, insbesondere zwischen solchen der gleichen Barrel-Reihe (Abb. 1), aufgezeigt [14]. Die Neurone der Granulärschicht weisen daher die kleinsten rezeptiven Felder auf. In den supragranulären Schichten sind die rezeptiven Felder der Neurone bereits größer, am größten sind sie schließlich in den infragranulären Schichten, wo einzelne Zellen auf den Ausschlag von wesentlich mehr Vibrissen reagieren als nur auf die Reizung derjenigen Vibrisse, die dem entsprechenden Barrel primär zugeordnet ist [6,19,77,78,95]. Der Informationsfluss in die infragranulären Schichten ist sowohl konvergenter als auch divergenter als der Informationsfluss in die supragranulären Schichten und die Granulärschicht [6,19,77]. Als Folge hat die Reizung einer einzelnen Vibrisse Auswirkungen auf Neurone in einem wesentlich breiteren Abschnitt in den infragranulären Schichten als in den supragranulären Schichten und der Granulärschicht. Es stellt sich die Frage, ob den Parallelen zwischen der Breite des Axonbaumes von VIP-Zellen und der Breite der rezeptiven Felder in den infragranulären Schichten des Barrel-Kortex eine direkte Kausalität zugrunde liegt.   Die Funktion von VIP-Neuronen im Barrel-Kortex Angesichts der vertikalen Ausdehnung und Orientierung ihrer Dendriten darf vermutet werden, dass VIP-Neurone eine bislang nur unvollständig untersuchte Fülle von unterschiedlichen Afferenzen in mehreren kortikalen Schichten erhalten und integrieren. Es ist bekannt, dass VIP-Neurone direkte thalamokortikale Afferenzen in den Barrels erhalten [84]. Die hier vorgestellten dendritischen Verzweigungsmuster legen nahe, dass vor allem VIP-Neurone, deren Somata in den supragranulären Schichten und der Granulärschicht liegen, Ziel dieser 46

 

thalamokortikalen Afferenzen sind. Viele dieser Neurone erreichen außerdem die Molekularschicht mit ihren Dendriten, die sich dort in auffälliger Weise verzweigen. Wenngleich noch nicht untersucht, ist es dennoch wahrscheinlich, dass diese Dendritenzweige in Schicht I von Fasern aus anderen neokortikalen Arealen afferentiert werden. Zumindest ist bekannt, dass die Molekularschicht von exzitatorischen Axonen aus dem ipsilateralen primär-motorischen und sekundär-somatosensorischen Kortex wie auch dem kontralateralen Parietalkortex [18] und aus den unspezifischen Thalamuskernen [56] durchsetzt wird. Welche Fasern im Einzelnen Kontakte mit VIP-Neuronen bilden, liegt allerdings im Dunkeln. Darüberhinaus sind Afferenzen von lokalen Pyramidenzellen auf VIP-Zellen im Frontalkortex der Ratte elektrophysiologisch nachgewiesen [71] und auch morphologisch dargestellt worden (Staiger, unveröffentlichte Beobachtung), zumindest in den supragranulären Schichten. Neben den exzitatorischen Afferenzen sind auch inhibitorische Kontakte auf VIP-Zellen in der Literatur beschrieben. So werden diese Neurone im Rattenkortex ausgiebig von Parvalbumin bildenden Korbzellen innerviert [81]. Parvalbumin-immunreaktive Neurone bilden eine wichtige Klasse von GABAergen, inhibitorischen Interneuronen und besitzen typische morphologische Eigenschaften von Korb- und Chandelier-Zellen [8,17,44]. Auch sie erhalten wie VIP-Neurone direkte, monosynaptische Afferenzen aus dem Nucleus ventralis posteromedialis thalami [85,87]; tatsächlich scheinen sie innerhalb der Gruppe der inhibitorischen Interneurone das Hauptziel der spezifischen thalamokortikalen Afferenzen darzustellen [85]. Im Gegensatz zu den VIP-Neuronen der Schichten I-Va bilden Korbzellen allerdings einen in der Horizontalebene weit ausladenden Axonplexus und sind daher möglicherweise die Grundlage für die laterale Inhibition im Barrel-Kortex, einem wichtigen Baustein in der Datenverarbeitung somatosensorischer Stimuli. Neben dem hemmenden Einfluss von Parvalbumin produzierenden Neuronen unterliegen VIP-Neurone außerdem vermutlich auch der Inhibition durch andere VIP-Zellen innerhalb des Kortex. So konnten im Laufe dieser Arbeit wiederholt einzelne VIP-immunreaktive Boutons in unmittelbarer Nähe von Dendriten und Somata anderer immungefärbter VIP-Zellen beobachtet werden. Unter anderem lagern sich VIP-immunreaktive Axone über längere Strecken an die Dendriten anderer VIP-Zellen an und bilden dabei axodendritische Bündel mit einer mutmaßlich höheren Anzahl von Synapsen ([80], eigene Beobachtung). Vermutlich werden die VIP-Zellen in den infragranulären Schichten über solche Kontakte in Lamina V von VIP-Neuronen der darüberliegenden Schichten innerviert. Somit scheinen zahlreiche unterschiedliche Afferenzen sowohl exzitatorischer als auch inhibitorischer Natur auf den VIP-Neuronen zusammenzulaufen. Die Zellen erhalten dadurch vermutlich einen umfassenden Eindruck vom Zustand der neuronalen Aktivität in dem entsprechenden lokalen, der Form des Dendritenbaumes entsprechend säulenartigen Kortexabschnitt. Angesichts der den VIP-Neuronen zugedachten Funktionen (siehe Einleitung) erscheint dies sehr zweckmäßig. Unterschiedliche Reaktionen von VIP-Neuronen auf die eingehenden Informationen kommen in Betracht und sollen im Folgenden theoretisch erörtert werden. Bezogen auf die Schichten I-IV einer Barrel-Kolumne soll, vereinfachend, die vom Nucleus ventralis posteromedialis thalami ausgehende Exzitation in Folge eines Vibrissenausschlags die wesentliche Quelle der Erregung sein. Diese Erregung breitet sich innerhalb der Barrel-Kolumne aus, erreicht aber auch schon zu einem frühen Zeitpunkt die direkt thalamokortikal afferentierten VIP-Neurone. Innerhalb einer bestimmten Kolumne werden die VIP-Neurone neben der thalamo-kortikalen Afferenz außerdem über ihre Dendriten durch Afferen- 47

 

zen in Schicht I erregt. Gegensätzlich dazu erhalten sie bei Erregung der benachbarten Barrel-Kolumne von den dort lokalisierten Korbzellen hemmende Einflüsse, die die erregenden Einflüsse aus der eigenen Kolumne abschwächen. Ferner wird die Aktivität der VIP-Zellen auch noch durch noradrenerge Fasern aus dem Locus coeruleus beeinflusst [67] (Abb. 22). Je nach Summe der exzitatorischen und inhibitorischen Einflüsse innerhalb des lokalen, meist auf eine Barrel-Kolumne beschränkten Kortexabschnitts setzen die Neurone unterschiedliche Mengen von VIP, GABA, Acetylcholin und anderen Stoffen im umliegenden Gewebe frei, bei starker Erregung mehr, bei schwacher Erregung weniger. GABA bewirkt eine Zügelung der Exzitation von benachbarten Neuronen. VIP stimuliert innerhalb des betroffenen Gewebes die Glykogenolyse, so dass im Falle einer erhöhten Aktivität rechtzeitig Substrate des Energiestoffwechsels bereitstehen. Acetylcholin und VIP stellen die lokalen Blutgefäße weit und gewährleisten dadurch eine angemessene Versorgung des Gewebes. Ferner modifizieren sie die neuronale Reaktion der umliegenden Zellen auf die Erregung der entsprechenden Barrel-Kolumne. Die Hauptaufgabe der VIP-Zellen innerhalb des kolumnären Zellgefüges wäre somit die frühzeitige Anpassung der Erregung innerhalb des entsprechenden Gewebeabschnittes und die Feineinstellung und Gewährleistung des Zellstoffwechsels, um diese Erregung zu unterhalten. Vom morphologischen Aspekt her erscheinen die weeping-willow-artigen Zellen in Schicht IV des Barrel-Kortex denkbar geeignet, dieser Aufgabe nachzukommen. über ihre Dendriten erhalten sie vermutlich direkte thalamokortikale Afferenzen, und über ihr Axon können sie das darüberliegende supragranuläre Gewebe beeinflussen, auf das sich die Exzitation im Rahmen der geschilderten Erregungsfortleitung innerhalb einer Barrel-Kolumne als nächstes fortpflanzen würde. Während sich ein solches Szenario in geschilderter Weise allerdings für die VIP-Zellen in den granulären und supragranulären Schichten entwickeln lässt, erscheint dies schwieriger für die VIP-Neurone in den infragranulären Schichten. Im Prinzip sollten sich die VIP-Zellen dort aber nicht wesentlich anders verhalten, und auch ihre Aufgabe soll in der Feineinstellung der Erregung und der Stoffwechselanpassung der Zellen im lokalen Gewebe bestehen, wenngleich die Schaltkreise der Erregung innerhalb der infragranulären Schichten nicht so einfach herzuleiten sind. Unter diesem Aspekt ist die im Rahmen dieser Arbeit aufgezeigte schichtenabhängige Assoziation von VIP-Zell-Axonen zu den barrel-bezogenen Kompartimenten einleuchtend erklärbar. Die relativ strikte Assoziation in den Schichten I-Va ist angesichts der noch relativ gut erhaltenen Spezifität der verarbeiteten Informationen hinsichtlich des jeweils zugeordneten Tasthaares zweckmäßig. In den Schichten Vb und VI hingegen ist diese Assoziation weitgehend aufgehoben infolge einer ausgeprägten horizontalen Kollateralisation. Insofern sind je nach der betrachteten isokortikalen Schicht mehr oder weniger Zellen in einem eher schmalen oder breiten Kortexabschnitt vom Einfluss einzelner VIP-Zellen betroffen. Es ergibt sich, dass eine einzelne VIP-Zelle in den infragranulären Schichten die Stoffwechselregulation innerhalb eines mehrere Barrel-Kolumnen umfassenden Gewebeausschnittes übernehmen kann. Dies steht in Einklang zur integrativen Funktion der infragranulären Schichten [6,77], deren Nervenzellen sich durch große, aber schwach ausgebildete rezeptive Felder auszeichnen und auf die Stimulation von mehr Vibrissen reagieren als die Neurone der darüberliegenden Schichten [6]. Demzufolge ist der in die infragranulären Schichten gerichtete Informationsfluss divergenter als in den oberen Schichten. Es erscheint daher sinnvoll, dass die entsprechenden lokalen VIP-Zellen die Anpassung des Gewebes an die auf einen spezifischen Reiz folgenden unterschiedlichen Erregungszustände in einem entsprechend ausgedehnteren Bereich durchführen müssen. Dieser Aufgabe werden sie durch ihren horizontal weiter kollateralisierenden Axonbaum gerecht. 48

 

Abb. 22: Die Afferenzen auf VIP-Neurone: Ein Schema. Zumindest in den supragranulären und granulären Schichten erhalten VIP-Neurone diverse exzitatorische und inhibitorische Afferenzen von unterschiedlichen Zellgruppen und Fasersystemen. Im einzelnen projizieren erregende thalamokortikale Afferenzen und noradrenerge (NA) Fasern aus dem subkortikalen Locus coeruleus über einzelne Synapsen auf sie. Vermutlich erhalten sie auf ihren prominenten Dendriten in Schicht I auch Afferenzen von den exzitatorischen Fasern unterschiedlichen, u.a. kortikalen Ursprungs, die durch die Molekularschicht ziehen. Ferner sind inhibitorische Synapsen von parvalbuminergen Korbzellen auf VIP-Somata beschrieben. Die Perikarya der Korbzellen können dabei aufgrund ihres breiten Axonbaumes auch in benachbarten Barrel-Kolumnen gelegen sein. über die Afferenzen auf VIP-Zellen im unteren Abschnitt des Kortex ist leider weniger bekannt. Es ist möglich, dass sie über in Schicht V bestehende axodendritische Kontakte ([80], eigene lichtmikroskopische Beobachtung) von VIP-Zellen in den darüberliegenden Schichten innerviert werden. In Abhängigkeit von den Afferenzen modulieren VIP-Zellen über ihr Axon den Stoffwechsel in einem vertikal (obere VIP-Zelle) oder in einem horizontal (untere VIP-Zelle) ausgerichten Bereich (der vom Axonbaum einer Zelle erfasste Bereich ist grau dargestellt). Die Schichten des Isokortex sind durch römische Zahlen am linken Bildrand bezeichnet. Barrels werden durch Fässer symbolisiert. W. S. = weiße Substanz. Als Beispiel sind hier lediglich VIP-Zellen innerhalb einer Barrel-Kolumne dargestellt. Zellen innerhalb der Septum-assoziierten Kolumnen verhalten sich entsprechend.   49

 

Zusammenfassung:   Vasoaktivem Intestinalem Polypeptid (VIP) im Kortex der Ratte kommt mutmaßlich eine besondere Funktion in der Steuerung und Förderung von Stoffwechselvorgängen und der neuronalen Aktivität von Nervenzellen zu. Es wird überwiegend in bipolaren, senkrecht zur pialen Oberfläche orientierten, GABA und teilweise auch Cholin-Acetyltransferase enthaltenden Interneuronen exprimiert. Aufgrund ihrer schlanken somatodendritischen Gestalt sind diese Zellen mit isokortikalen kolumnären Organisationsmustern in Verbindung gebracht worden, die mit den Barrels des primär-somatosensorischen Kortex der Ratte ein morphologisches Korrelat besitzen. Um eine Assoziation von VIP-Zellen und Barrels aufzuzeigen, wurde die immunhistochemische Darstellung von VIP in seinen Ursprungszellen und die Darstellung von Barrels durch das Sichtbarmachen ihrer Cytochromoxidase-Aktivität auf histologischen Schnitten durch die Tiefe des primär-somatosensorischen Kortex kombiniert. VIP-Neurone fanden sich in den supragranulären (48% aller VIP-Neurone) und infragranulären Schichten (36%) sowie in den Barrels und den Septa der Granulärschicht (16%). Einzelne Zellen fanden sich auch in der weißen Substanz. Innerhalb der Granulärschicht wurden mehr VIP-Neurone in den Septen zwischen den Barrels als in den Barrels gefunden. Dieser Trend schlug sich in einer Zelldichte nieder, die innerhalb der Barrels um ein Drittel niedriger war als in den Septa. Zur genauen Untersuchung ihrer Gestalt wurden VIP-Zellen aus den unterschiedlichen Schichten mit einem Computermikroskop und der Neurolucida-Software über zusammenhängende Serienschnitte dreidimensional rekonstruiert. Die rekonstruierten Nervenzellen wiesen überwiegend typische Eigenschaften von bipolaren, einfach oder zweifach gebüschelten Neuronen auf. Hinsichtlich der Gestalt des Axons fanden sich schichtenspezifische Unterschiede zwischen 1.) VIP-Neuronen in den supragranulären Schichten, der Granulärschicht und dem oberen Abschnitt der infragranulären Schichten, etwa entsprechend Schicht Va, einerseits und 2.) den VIP-Neuronen im unteren Abschnitt der infragranulären Schichten andererseits. Erstere besaßen Dendriten, die oft bis in die Schicht I hineinragten und sich dort mehrfach dichotom verzweigten, sowie vertikal orientierte Axonbäume, deren tangentialer Durchmesser stets deutlich geringer war als die Breite einer Barrel-Kolumne. Daher blieben sowohl der Dendriten- als auch der Axonbaum dieser Zellen meist auf die Kolumne, in der sich das Soma der Neurone befand, beschränkt. Die VIP-Neurone der zweiten Gruppe hingegen waren gekennzeichnet durch Dendriten, die nicht über die Schicht-IV-V-Grenze hinausreichten, und Axone mit oft langen horizontalen Kollateralen, die sich über zwei oder mehr Barrel-Kolumnen erstreckten. Die genannten Gruppen von VIP-Zellen werden diskutiert als mögliche Anpassung an die unterschiedlichen Formen der Informationsverarbeitung in den entsprechenden Schichten. So modulieren die VIP-Neurone den Gewebestoffwechsel einmal in einer spezifisch afferentierten, umschriebenen Region in den oberen Schichten des Kortex und in einer eher extensiv afferentierten, integrativ arbeitenden, breiteren Region in den unteren Schichten.       50

 

Danksagung:   Mein Dank gilt Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Zilles für seine wertvollen Anregungen und seine Diskussionsbereitschaft und seine wohlwollende Unterstützung in allen wissenschaftlichen Fragen. Seiner Erfahrung und seinem Scharfsinn gebührt mein ganzer Respekt. Ferner danke ich Herrn Dr. med. Jochen Staiger, der mich als den ersten von ihm betreuten Doktoranden mit allem erdenklichen Idealismus betreut und beraten und diese Arbeit erst ermöglicht hat. Für seine Freundlichkeit, seine Freundschaftlichkeit und sein jederzeit offenes Ohr danke ich ihm von Herzen. Einen besonderen Dank zolle ich Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Egbert Welker, der mir meinen Aufenthalt in Lausanne ermöglicht, mich betreut und mir meine Augen für alle erdenklichen wissenschaftlichen und menschlichen Fragen geöffnet hat. Herrn Dr. Rudolf Kraftsik danke ich für seine freundliche Einarbeitung in das Neurolucida-System und für seinen Rat bei statistischen Fragestellungen. Herrn Dr.-Ing. Schleicher danke ich für seine Unterstützung bei der statistischen Auswertung der vorliegenden Ergebnisse. Herrn Dr. Laurent Tettoni danke ich für die freundliche Einweisung in die beeindruckende, von ihm mitentwickelte Software Maxsim. Herrn Dr. Tamas Görcs danke ich für die freundliche Bereitstellung des VIP-Antikörpers. Frau Opfermann-Rüngeler danke ich für ihre Beratung bei der Erstellung meines Posters für Berlin. Diese Arbeit wurde mit der wertvollen Unterstützung der European Science Foundation im Rahmen des European Neuroscience Program durchgeführt. Ich bedanke mich von Herzen bei allen Menschen, deren Hilfe mir im Rahmen dieses Stipendiums zuteil geworden ist. Der Neurowissenschaftlichen Gesellschaft danke ich für die großzügige Vergabe eines Reisestipendiums zur Teilnahme am Treffen der European Neuroscience Association in Berlin (27.06. - 01.07. 1998).       51

 

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Anhang: Programme   CONVAX ver 2.02 für Windows 95 Convax 2.02 für Windows 95 wurde entwickelt, um mit der Software Neurolucida 2.0 rekonstruierte Zellen in ein gängiges Metafile-Format zu konvertieren. Der Vorteil gegenüber den übrigen Methoden, Neurolucida-Dateien in einem verwertbarem Graphikformat auszugeben, liegt in der größeren Authentizität der durch Convax produzierten Graphikdateien. Die Dicke von Zellfortsätzen wird im Verhältnis korrekt dargestellt. Außerdem sind mit Convax erstellte Dateien effizienter zu bearbeiten als die von Neurolucida exportierten Formate. Zur Bearbeitung stehen mächtige Graphikprogramme unterschiedlicher Anbieter zur Verfügung, wie beispielsweise CorelDraw!, mit dem die in dieser Arbeit enthaltenen Nervenzellabbildungen erstellt worden sind.     Convax stellt sowohl Einzelzellrekonstruktionen als auch im Kartierungsmodus von Neurolucida erstellte Dateien graphisch dar und gibt sie als Metafiles sowohl im CGM- (Computer Graphics Metafile) als auch im GEM-Format (Graphics Environment Manager) aus. Der Benutzer ist in der Lage, die Zellen um die drei Hauptachsen X, Y und Z zu rotieren sowie die Farben der Strukturen, unterschiedliche Dicken für Varikositäten und Zellfortsätze sowie Schrumpfungsfaktoren in diversen Dialogfenstern einzugeben. Eine ausführliche Online-Hilfefunktion und Referenz sind dem Programm beigefügt. 60

 

Der Quelltext zu Convax wurde von mir in der Programmiersprache C geschrieben. Neben einer Befehlszeilenversion für MS-DOS liegt auch eine Version für die Windows 95/98 Graphical Device Interface mit erweiterten Funktionen vor. Beide Versionen sind sowohl als ausführbare Dateien als auch als Quelltext mit der Erlaubnis zur Weitergabe und Modifikation im Internet unter www-public.rz.uni-duesseldorf.de/˜bayrakta frei erhältlich.   RETRAX Neurolucida in der Version 2.0 unterstützte nur unzureichend die retrograde Rekonstruktion von Nervenzellfortsätzen. Obwohl die aus der retrograden Rekonstruktion hervorgehenden Dateien durch Neurolucida korrekt dargestellt wurden, konnten sie beispielsweise nicht in die Auswertungsprogramme NeuRotate oder Morph eingelesen und untersucht werden. Retrax ist ein von mir in C++ geschriebenes Befehlszeilenprogramm, das dem Abhilfe leisten soll. Es organisiert die von Neurolucida nach einer retrograden Rekonstruktion erstellte Datenliste in einer Weise um, dass die resultierende, neue Datenliste sich bis auf Details nicht von der einer konventionell anterograd rekonstruierten Zelle unterscheidet. Die von Retrax hervorgebrachten ASCII-Dateien lassen sich sowohl mit Morph und Convax als auch - nach Konvertierung in das binäre Neurolucida-2.0-Format - mit NeuRotate öffnen und enthalten die gleichen Informationen wie die Ursprungsdateien. Folgendes einfaches Beispiel zeigt die Datenliste* einer Axonrekonstruktion, die an einem beliebigen Punkt im Verlauf des Axon begonnen worden ist (Punkt 2). Folglich ist die Rekonstruktion in zwei Abschnitten durchgeführt worden, zuerst retrograd zurück zum Axoninitialsegment (Punkt 1), danach in entgegengesetzter Richtung zum Ende des Axons (Punkt 3) (Pfeile). Diese Datenliste kann, außer durch Neurolucida, durch keines der genannten Programme geöffnet werden.   *   Zum Format der Datenliste: Jede Zeile der Datenliste ist einem räumlichen Punkt der Rekonstruktion eindeutig zugeordnet. Mehrere Zeilen der Datenliste können auf den gleichen Punkt verweisen. Eine Zeile enthält einen Code-Teil (in eckigen Klammern), einen Koordinatenteil (X-, Y- und Z-Koordinaten, in runden Klammern) und eine Dickeninformation (Radius des Zellfortsatzes in Mikrometern). Der einleitende Code lässt sich ferner unterteilen in einen Major- und in einen Minor-Code. Der Major-Code ist kennzeichnend für die Art des Punktes, der durch die vorliegende Zeile definiert wird (Beispiele: 1 für den Endpunkt einer einfachen Linie, 2 als Sprungmarke, 10 u.a. für den Anfangspunkt der Rekonstruktion und für die diversen Endpunkte). Der Minor-Code typisiert den Punkt, ausgehend vom Major-Code, noch weiter und bezeichnet unter anderem, um welchen Teil der Nervenzelle es sich handelt (z.B. das Axon im vorliegenden Beispiel).   61

 

Retrax versetzt den anatomischen Ursprung des Axons, das Axoninitialsegment, aus der Mitte der Datenliste an ihren Anfang. Das Ende des Axons kommt dementsprechend an das Ende der Datenliste. Der Punkt, an dem die Rekonstruktion begonnen wurde, liegt irgendwo in der Mitte der Datenliste und ist nur noch durch den Code [33,21] (old beginning) als solcher zu erkennen. Die entstandene ASCII-Datei kann von allen Programmen geöffnet werden.       62

 

Lebenslauf:   22.02. 1973 Geburt in Homberg / Efze in Hessen als zweiter Sohn des türkischen Ärzteehepaares Frau Inci Bayraktar und Herrn Dr. Aydin Bayraktar. 1979 - 1992 Schulausbildung in der Sichel-Grundschule in Balingen / Baden-Württemberg sowie in der Paul-Gerhart-Grundschule und dem Gymnasium Fabritianum in Krefeld-Uerdingen. Abschluss mit Allgemeiner Hochschulreife als Jahrgangsbester. 07.09. 1987 Annahme der deutschen Staatsangehörigkeit. 01.07. 1992 - 30.09. 1993 Zivildienst in den Städtischen Krankenanstalten Krefeld im Pflegedienst. 01.10. 1993 Beginn des Medizinstudiums an der Heinrich-Heine-Universität in Düsseldorf. Frühjahr 1995 Beginn der Dissertationsarbeit am C. & O. Vogt-Institut für Hirnforschung bei Herrn Universitätsprofessor Dr. Zilles unter der Mitbetreuung durch Herrn Dr. Jochen Staiger. September 1995 Physikum. April - Mai 1996 Teilnahme am European Neuroscience Programme der European Science Foundation (Straßburg) als Kurzzeit-Stipendiat während eines Urlaubssemesters. Im Rahmen dessen Aufenthalt am Anatomischen Institut der Universität Lausanne (Direktor: Universitätsprof. Dr. G. Innocenti) unter der Betreuung von Herrn Dr. Egbert Welker. Erlernen der computergestützten, dreidimensionalen Rekonstruktion von Nervenzellen mit dem Neurolucida-System. März 1997 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung. Sommer 1997 Veröffentlichung der Kolokalisationsstudie über VIP-Zellen in Brain Research [10]. Januar 1998 Beginn der Mitgliedschaft in der Neurowissenschaftlichen Gesellschaft (Berlin). 27.06. - 01.07. 1998 Teilnahme am jährlichen Kongress der European Neuroscience Association in Berlin, finanziert durch ein Reisestipendium der Neurowissenschaftlichen Gesellschaft. Präsentation von VIP-Zellrekonstruktionen während einer Postersitzung. März 1999 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung. April 1999 Beginn des 3. Klinischen Abschnitts des Medizinstudiums (Praktisches Jahr) am Universitätsklinikum Düsseldorf unter den Klinikdirektoren Herrn Universitätsprofessor Dr. Freund (Wahlfach Neurologie), Herrn Universitätsprofessor Dr. Häussinger (Gastroenterologie / Innere Medizin) und Herrn Universitätsprofessor Dr. Röher (Chirurgie). Mai 2000 3. Abschnitt der ärztlichen Prüfung.   63

 

VIP-immunreaktive Neurone im primär-somatosensorischen Kortex der adulten Ratte: Immunzytochemische Charakterisierung und dreidimensionale Rekonstruktion Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin, vorgelegt von Tan Bayraktar Abstract: Vasoaktivem Intestinalem Polypeptid (VIP) im Kortex der Ratte kommt mutmaßlich eine besondere Funktion in der Steuerung und Förderung von Stoffwechselvorgängen und der neuronalen Aktivität von Nervenzellen zu. Es wird überwiegend in bipolaren, senkrecht zur pialen Oberfläche orientierten, GABA (Gamma-Aminobuttersäure) und teilweise auch Cholin-Acetyltransferase enthaltenden Interneuronen exprimiert. Aufgrund ihrer schlanken somatodendritischen Gestalt sind diese Zellen mit isokortikalen kolumnären Organisationsmustern in Verbindung gebracht worden, die mit den Barrels des primär-somatosensorischen Kortex der Ratte ein morphologisches Korrelat besitzen. Um eine Assoziation von VIP-Zellen und Barrels aufzuzeigen, wurde die immunhistochemische Darstellung von VIP in seinen Ursprungszellen und die Darstellung von Barrels durch das Sichtbarmachen ihrer Cytochromoxidase-Aktivität auf histologischen Schnitten durch die Tiefe des primär-somatosensorischen Kortex kombiniert. VIP-Neurone fanden sich in den supragranulären (48% aller VIP-Neurone) und infragranulären Schichten (36%) sowie in den Barrels und den Septa der Granulärschicht (16%). Einzelne Zellen fanden sich auch in der weißen Substanz. Innerhalb der Granulärschicht wurden mehr VIP-Neurone in den Septen zwischen den Barrels als in den Barrels gefunden. Dieser Trend schlug sich in einer Zelldichte nieder, die innerhalb der Barrels um ein Drittel niedriger war als in den Septa. Zur genauen Untersuchung ihrer Gestalt wurden VIP-Zellen aus den unterschiedlichen Schichten mit einem Computermikroskop und der Neurolucida-Software über zusammenhängende Serienschnitte dreidimensional rekonstruiert. Die rekonstruierten Nervenzellen wiesen überwiegend typische Eigenschaften von bipolaren, einfach oder zweifach gebüschelten Neuronen auf. Hinsichtlich der Gestalt des Axons fanden sich schichtenspezifische Unterschiede zwischen 1.) VIP-Neuronen in den supragranulären Schichten, der Granulärschicht und dem oberen Abschnitt der infragranulären Schichten, etwa entsprechend Schicht Va, einerseits und 2.) den VIP-Neuronen im unteren Abschnitt der infragranulären Schichten andererseits. Erstere besaßen Dendriten, die oft bis in die Schicht I hineinragten und sich dort mehrfach dichotom verzweigten, sowie vertikal orientierte Axonbäume, deren tangentialer Durchmesser stets deutlich geringer war als die Breite einer Barrel-Kolumne. Daher blieben sowohl der Dendriten- als auch der Axonbaum dieser Zellen meist auf die Kolumne, in der sich das Soma der Neurone befand, beschränkt. Die VIP-Neurone der zweiten Gruppe hingegen waren gekennzeichnet durch Dendriten, die nicht über die Schicht-IV-V-Grenze hinausreichten, und Axone mit oft langen horizontalen Kollateralen, die sich über zwei oder mehr Barrel-Kolumnen erstreckten. Die genannten Gruppen von VIP-Zellen werden diskutiert als mögliche Anpassung an die unterschiedlichen Formen der Informationsverarbeitung in den entsprechenden Schichten. So modulieren die VIP-Neurone den Gewebestoffwechsel einmal in einer spezifisch afferentierten, umschriebenen Region in den oberen Schichten des Kortex und in einer eher extensiv afferentierten, integrativ arbeitenden, breiteren Region in den unteren Schichten. Abstract genehmigt durch:   Tan Bayraktar Universitätsprofessor Dr. med. K. Zilles