Dokument: Untersuchungen zur osteogenen Differenzierung auf mRNA- und microRNA-Ebene

Titel:Untersuchungen zur osteogenen Differenzierung auf mRNA- und microRNA-Ebene
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20080703-111027-1
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Krause, Sabine [Autor]
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Dateien vom 18.06.2008 / geändert 18.06.2008
Beitragende:Prof. Dr. Wernet, Peter [Gutachter]
Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:Die osteogene Differenzierung unterliegt einem komplizierten Regulationsmechanismus. Trotz Identifikation einiger Transkriptionsfaktoren und osteospezifischer Markergene ist die Regulation nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Arbeit wurden daher umfassende globale Genexpressionsanalysen osteogen differenzierter Stammzellen durchgeführt. Verwendet wurden dafür Stammzellen aus dem Nabelschnurblut (USSC), mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (MSC) und eine potentielle Nierentumorstammzelllinie. Die erhaltenen Daten wurden mittels qPCR verifiziert, wobei eine gute Übereinstimmung gezeigt werden konnte. Neben den bekannten osteospezifischen Genen wurden weitere potentiell stammzellerhaltende Gene identifiziert (DLX2, FOXP1, GATA6 und PLAUR).
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-proteinkodierende RNAs, die die Proteinexpression durch Bindung an den 3’-untranslatierten Bereich der mRNA negativ regulieren können. Das kann entweder über RNA-Abbau oder Hemmung der Translation geschehen. Von den wenigsten der 541 humanen miRNAs ist die genaue Funktion bekannt. Jedoch werden einige miRNAs im Zusammenhang mit Entwicklung, Proliferation und Differenzierung von Zellen bzw. der Deregulation von miRNAs in diversen Krankheiten beschrieben. Um die mögliche Rolle von miRNAs während der osteogenen Differenzierung genauer zu untersuchen, wurden daher miRNA-Expressionsprofile der osteogen differenzierten Zellen mittels miRNA-qPCR erstellt. Diese Analysen ergaben insgesamt 13 differentiell exprimierte miRNAs, wovon sieben miRNAs im Laufe der osteogenen Differenzierung vermindert und sechs erhöht exprimiert waren. Über In-silico-Zielgenvorhersagen wurden die globalen Genexpressionsanalysen und die miRNA-Expressionsprofile auf potentielle mRNA-miRNA-Interaktionen überprüft, die in mRNA-Abbau resultiert – es wurden 17 übereinstimmende Resultate gefunden. Für die funktionelle Analyse dieser Interaktionen wurde zunächst ein Luciferaseassay etabliert. Die vorhergesagte Bindung von miR-26a an das differenzierungsrelevante Gen GATA6 konnte allerdings nicht bestätigt werden, was die Limitierung dieser computergestützten Vorhersagen verdeutlicht.
Um die Rolle von miRNAs in der osteogenen Differenzierung weitergehend untersuchen zu können, wurde ein System zur Überexpression von miRNAs etabliert. Das System kann für transiente und stabile Überexpressionen verwendet werden. Es wurde deutlich, dass miRNAs nicht unbegrenzt überexprimiert werden können und nach ca. drei Wochen nur noch die Überexpression der miRNA-Vorläufer nachweisbar war, während die Expression der biologisch aktiven miRNA nur leicht erhöht war.

The osteogenic differentiation is subject to a complex mechanism of regulation. Despite the identification of some relevant transcription factors and osteogenic specific genes, the whole regulation is not yet fully understood.
Therefore, in this thesis extensive global gene expression analyses of osteogenic differentiated stem cells were made. Unrestricted somatic stem cells from cord blood (USSC), mesenchymal stem cells from bone marrow (MSC), and a potential renal tumour stem cell line were used. The results from these experiments were verified using qPCR which showed a good overall correlation. In addition to the known osteo-specific genes also new potentially stem cell renewing genes were identified (DLX2, FOXP1, GATA6 and PLAUR).
MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs which negatively regulate protein expression by binding to the 3’ untranslated region of mRNAs. The mRNAs can then either be cleaved or translation can be inhibited. Only a few out of the 541 human miRNAs have a known biological function. However, miRNAs were found to be linked to many biological processes such as development, proliferation, and differentiation of cells as well as to deregulation in multiple diseases like cancer. To further examine the possible role of miRNAs in osteogenic differentiation, miRNA expression profiles of the same osteogenic differentiated cells were determined using miRNA-qPCR. These data showed 13 differentially expressed miRNAs of which seven were downregulated and six were upregulated during osteogenic differentiation.
Using in silico target prediction, global gene expression analyses and miRNA expression profiles were screened for potential mRNA-miRNA interactions which led to mRNA cleavage – 17 consistent results were found. To validate these mRNA-miRNA interactions a luciferase assay was established. However, the predicted binding of miR-26a to the differentiation relevant gene GATA6 could not be confirmed which demonstrated the limitations of these computer based predictions.
To further investigate the role of miRNAs during osteogenic differentiation, a system for overexpressing miRNAs was established. It can be used for both transient and stable overexpression. It became apparent that miRNA overexpression is temporary. After approxymately three weeks only miRNA precursor were detected while expression of biological active miRNAs was only slightly increased.
Lizenz:In Copyright
Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika (ITZ)
Dokument erstellt am:18.06.2008
Dateien geändert am:18.06.2008
Promotionsantrag am:02.05.2008
Datum der Promotion:28.05.2008
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