Dokument: Mechanistische Analysen einer T-Zell-abhängigen humoralen in vitro Immunreaktion

Titel:	Mechanistische Analysen einer T-Zell-abhängigen humoralen in vitro Immunreaktion
Weiterer Titel:	Mechanistic analysis of a T cell dependent humoral in vitro immune response
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28181
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140127-135111-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Fischer-Berenbein, Anna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,05 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.01.2014 / geändert 24.01.2014
Beitragende:	PD Dr. Vohr, Hans-Werner [Gutachter] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das vordringliche Ziel der Dissertation war es, die Einsatzmöglichkeiten von T-Zell-abhängigen humoralen in vitro Immunreaktionen für toxikologische Testungen zu erweitern und zu prüfen. Dazu wurden im ersten Schritt die Testkulturbedingungen durch Ändern diverser Parameter, u.a. Zellkulturmedium, Stimulationszeitpunkt und Zellkulturdauer, an primäre Milzzellen aus Ratten sowie an PBMC aus Nagern und Primaten angepasst. Dabei konnte gezeigt werden, dass für Rattenmilzzellen und PBMC im Gegensatz zu Mausmilzzellen die Supplementierung mit β-Mercaptoethanol (2-ME) erforderlich war. Für PBMC aus Primaten war zusätzlich die Inkorporation von Typ I Interferon für die Ausbildung einer in vitro Immunreaktion gegen SRBC notwendig. Die etablierten Bedingungen wurden für Zellen diversen Ursprungs nach Optimierung der Zellkultur als reproduzierbar, robust und auch von anderen Experimentatoren durchführbar bestätigt. Außerdem wurden die etablierten Testsysteme auf ihre Eignung für toxikologische Prüfungen untersucht. Mit einer Auswahl an Testsubstanzen, sowohl Kontrollsubstanzen als auch Immunsuppressiva, wurde eine hohe Sensitivität für den reinen in vitro Test mit Milzzellen aus Wistarratten ermittelt. Durch einen Vergleich von in vitro Stimulationen von PBMC aus immunsupprimierten Ratten mit in vivo Immunisierungen im Standardtest (ex vivo TDAR) erwiesen sich beide Methoden als prädiktiv. Als Vorteil gegenüber dem TDAR, bietet der MD Test mit PBMC die Möglichkeit einer zeitlichen Verfolgung von Immunstatusänderungen der Versuchstiere während der Behandlung. Durch Ersatz des TDAR mit der alternativen Methode wären Immunisierungen von Studientieren in damit einhergehenden Satellitengruppen nicht mehr notwendig, sodass die Versuchstierzahlen für Immuntoxizitätsprüfungen deutlich reduziert werden könnten. Durch die Charakterisierung der SRBC-spezifischen in vitro Immunreaktion wurden vergleichbare Vorgänge zur in vivo Situation ermittelt. So zeigten Depletionsexperimente die Notwendigkeit von antigenpräsentierenden Zellen, T- und B-Zellen für die humorale in vitro Immunreaktion auf und durchflusszytometrische Untersuchungen von Zelloberflächenmarkern dokumentierten eine Zunahme ihrer spezifischen Zellaktivierung im zeitlichen Verlauf. Zytokinmessungen deuteten auf ein Th2-ähnliches Zytokinprofil hin. Genexpressionsanalysen von T-Helferzellen belegten eine zeitabhängige Deregulierung von immunsystem- und metabolismusrelevanten Genen in vitro, welche analog zu beschriebenen Immunreaktionen in vivo exprimiert wurden. Im letzten Teil der Dissertation wurde der Einfluss von 2-ME auf die humorale in vitro Immunreaktion in primären Milzzellen und PBMC aus Ratten analysiert. Dabei wurde eine Notwendigkeit von 2-ME sowohl für die Antikörpersezernierung, die spezifische T-Zellaktivierung, die Zytokinausschüttung als auch für die Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichts in den Zellen gezeigt. Eine vom Aktivierungsstatus der Zellen abhängige Redoxregulation in T- und B-Zellen wurde durchflusszytometrisch nachgewiesen und Genexpressionsanalysen verifizierten 2-ME-bedingte Deregulierung von mit reaktiven Sauerstoffspezies-assoziierten Genen und Glutathionmetabolismusgenen in T-Helferzellen. Zudem wurden weitere durch 2-ME differenziell exprimierte Gene identifiziert, welche den Kategorien Immunsystem, Zytoskelett und Zelladhäsion, Differenzierung, Proliferation, Apoptose, Transport und Metabolismus zugeordnet werden konnten. This dissertation primary aims to widen and to proof the use of T cell dependent humoral in vitro immune responses for immunotoxicological testing. Therefore, cell culture conditions, e.g. culture media, timing of stimulation and duration of cell culture, were adapted to primary rat splenocytes and to PBMC of rodent and primate origin. Rat spleen cells and PBMC in general were shown to require supplementation of β-mercaptoethanol (2-ME) in contrast to murine splenocytes. Furthermore, primate PBMC needed additional incorporation of a type I interferon for sufficient SRBC specific antibody production. After optimization of cell culture parameters, the established conditions were found to be reproducible, robust, and transferable to other labs. As a next step the applicability of in vitro antibody responses for toxicological testing was evaluated. Using a selection of test compounds including control chemicals and immunosuppressants, a high sensitivity of the in vitro assay was determined for spleen cells of Wistar rats. Comparison of the gold standard ex vivo TDAR and associated in vivo immunizations with in vitro stimulations of PBMC from immunocompromised rats confirmed the predictivity of both methods. As an advantage over TDAR, MD cultures offer the possibility of monitoring immune state changes of the animals during treatment over time, i.e. to monitor kinetics of immune response ex vivo. Apart from this, immunization of animals is not required for the in vitro antibody response. Hence, satellite groups of animals, often included in immunotoxicity studies for performing the TDAR, may also be omitted. Thus, replacing the TDAR by MD cultures will significantly reduce the number of animals used for toxicological investigations. Through characterization of the SRBC dependent in vitro immune response, comparable processes to the in vivo situation were observed. Depletion of APC, T and B cells attested their need for the humoral in vitro immune reaction. By means of flow cytometric analysis of cell surface markers, an increase of specific and time constraint cell activation with a Th2 related cytokine profile was documented. Microarray experiments of T helper cells revealed an in vivo like profile of differently expressed immune system and metabolism related genes in a time dependent manner in vitro. Analyzing the influence of 2-ME on in vitro antibody responses, its demand for antibody production, specific T cell activation, and cytokine secretion was found in primary rat splenocytes as well as in PBMC. Finally, 2-ME was important for maintaining a highly regulated redox balance , which depends on the cell activation state in T and B cells. Furthermore, a 2-ME regulated expression profile in T helper cells of reactive oxygen species associated genes, and genes involved in glutathione turnover was confirmed. Other identified genes, which were differently expressed due to 2-ME, were grouped into following categories: immune system, cytoskeleton, cell adhesion, differentiation, proliferation, apoptosis, transport, and metabolism.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	27.01.2014
Dateien geändert am:	27.01.2014
Promotionsantrag am:	25.07.2013
Datum der Promotion:	13.01.2014