Dokument: Isolierung und Strukturaufklärung von Bioaktiven Sekundärmetaboliten aus dem Schwamm Assoziierten Pilz Aspergillus sp.

Titel:	Isolierung und Strukturaufklärung von Bioaktiven Sekundärmetaboliten aus dem Schwamm Assoziierten Pilz Aspergillus sp.
Weiterer Titel:	Isolation and Structure Elucidation of Bioactive Secondary Metabolites from the Sponge-Associated Fungus Aspergillus sp.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21815
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120709-102038-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Zhou, Yaming [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.07.2012 / geändert 06.07.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Peter Proksch [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter] Prof. Dr. Wenhan Lin [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Marine Mikroorganismen haben sich als ergiebige Quelle von strukturell interessanten und biologisch aktiven Naturstoffen erwiesen. Insbesondere haben marine Pilze die Aufmerksamkeit auf sich gezogen durch die Diversität an chemischen Inhaltsstoffen und beobachteten biologischen Aktivitäten ihrer sekundären Metaboliten. Marine Pilze wurden aus verschiedenen Organismen isoliert, einschließlich Algen, Muscheln und im besonderen, Schwämmen. Jedoch erwiesen sich schwammassoziierte Pilze als produktivste Quelle für bioaktive Stoffe. Zudem zeigten die meisten Substanzen aus schwammassoziierten Pilzen eine signifikante Biokativität in einigen pharmakologischen Bioassay Projekten. Daher könnten diese interessante Kandidaten sein, um Leitstrukturen für die Entwicklung neuer Pharmaka, primär auf dem Feld der Zytostatika, Entzündungshemmer, Antiinfektiva und Analgetika, bereitzustellen. Folglich war es das Ziel dieser Arbeit, sekundär Metabolite aus dem marinen Pilz Aspergillus sp., isoliert aus dem mediterranem Schwamm Tethya auratium, zu identifizieren und auf das pharmakologische Potential zu untersuchen. Die Großkultivierung des Pilzen zur Isolierung und Identifizierung von Sekundärmetaboliten wurde auf zwei unterschiedlichen Medien durchgeführt, und zwar auf Bio-Malz Agar und festem Dinkel-Gerste Medium für 21 Tage bei 22°C. Die von beiden Medien gewonnen Kulturen wurden lyophilisiert, mit Ethylacetat extrahiert und der nach dem Abroutieren zurückbleibende trocken Rückstand mit Petrolether entfettet. Die daraus resultierende Fraktion wurde anschließend unterschiedlichen chromatographischen Separierungsverfahren zugeführt um die Sekundärmetabolite zu isolieren. Zur Identifikation von Molekulargewicht und Struktur der Sekundärmetabolite wurden in erster Linie Verfahren der Massenspektrometrie (MS) und der Magnetresonanz-Experimente (NMR) verwendet. Zudem wurde in Einzelfällen, bei optisch aktiven Naturstoffen, eine Time-dependent Density Funcional Theory Electronic Circular Dichroism (TDDFT ECD) Berechnungen durchgeführt um deren absolute Konfiguration festzustellen. Schließlich wurden alle isolierten Substanzen unterschiedlichen Bioassays zugeführt, wie z.B. Zytotoxizitäts- und antimikrobiellen Assays, um deren Bioaktivität festzustellen. Die chromatographische Auftrennung des Rohextraktes vom schammassoziiertem Pilz Aspergillus sp. ergab elf bekannte Polyketide (1-7, 16-18, und 28), sechs neue Meroterpenoide (10-14 und 29), zwölf Alkaloide einschließlich einem neuen Thyotoquivalin (20), sechs neue Fumiquinazolone (21-26), ein neues Tryptophan-Alkaloid (31) als auch vier bekannte Alkaloide (8, 9, 19, und 27), einen neuen Biphenylether (30) und ein bekanntes Nukleosid (15). Bei den meisten in dieser Studie isolierten Polyketiden waren Citrinin-Derivate. Zusätzlich wurde Butyrolacton II (1) als Hauptsekundärmetabolit des untersuchten Aspergillus sp. isoliert. 4-Acetyl-3,4-dihydro-6,8-dihydroxy-5-methyl Isocoumarin (5) zeigte eine ausgeprägte Zytotoxizität gegen mehrere ausgewählte Zelllinien, wohingegen alle anderen Polyketide keine oder eine nur sehr schwache Aktivität gegen die murine Lymphomzellline L5178Y zeigte. Die unbekannten meroterpenoiden Substanzen, Austalide M-R (10-14 und 29), zeigten sich strukturell verwandt mit den bekannten Austaliden A-L, welche zuvor aus Aspergillus ustus isoliert wurden. Die strukturelle Analyse der Austalide legt einen Biosyntheseweg nahe, welcher 6-Farnesyl-5,7-dihydroxy-4-methylphtalid enthält, ein wichtiges Zwischenprodukt in der Biogenese von Mycophenolsäure. Darüber hinaus wurden TDDFT ECD Berechnungen der Austalide M-Q (10-14), neue Metabolite von Aspergillus sp., vorgestellt. ECD Berechnungen gaben Aufschluss über die absolute Konfiguration und zeigten zudem, dass die Konformation des Chromophors, wie auch der charakteristische ECD-Cotton Effekt im benzylischen Zentrum, durch das Phtalid bestimmt wird. Die Berechnungen erklärten außerdem die bemerkenswerten Unterschiede der ECD-Spektren der strukturell verwandten Austalide und zeigen, dass die absolute Geometrie nicht durch einen einfachen Vergleich von ECD-Spektren ermittelt werden kann. Letztendlich zeigten diese Verbindungen jedoch nur eine schwache, oder keine Aktivität gegenüber der murinen Lymphomzelllinie L5178Y. Die bekannten Alkaloide 8, 9 und 19 wurden zum ersten Mal aus einem schwammassoziierten Pilz charakterisiert, während in frühere Studien bereits die Isolierung von Aspergillus fumigatus aus Meeressediment, Aspergillus fumigatus aus der Raumluft von Asthma-Patienten und Trichoderma sp. aus Bambusblättern beschrieben wurde. Verbindung 8 und 9 zeigten eine ausgeprägte Zytotoxizität gegen die Mauslymphomzelllinie L5158Y mit IC50 Werte von 3,7 und 0,2 µM, während 19 nur eine schwache Aktivität in diesem Assay zeigte. Darüber hinaus zeigte 9 getestet auf menschlichen Zelllinien, eine moderate Aktivität gegen ovariale Karzinomzellen (A2780sens) und die Philadelphia Chromosom positive, chronische myeloische Leukämie Zelllinie (K562) mit IC50 Werten zwischen 8,0 und 19,3 µM, während 8 nur eine moderate bis schwache Aktivität gegenüber K562, A2780sens und A2780CisR mit IC50 Werten von 15,0, 18,5 und 38,8 µM zeigte. Die Verbindungen 20-26 sind neue Tryptoquivaline- und Fumiquinazolonalkaloide. Die wichtigsten strukturellen Unterschiede zwischen denen in dieser Studie neu erfassten Vertretern und den bereits zuvor beschriebenen Verbindungen mit gleichem molekularem Gerüst, ist die Einbeziehung eines seltenen Aminosäurerests, 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure, anstelle von Alanin- oder Methylalaninresten, wie es in den früher berichteten Analoga zu finden ist. Die absolute Konfiguration von Tryptoquivalin K (20) und Fumiquinazolon K (21) wurde durch TDDFT ECD Berechnungen der Lösung ihrer Konformere untersucht und die ECD letzterer wurden auch verwendet um eine strukturelle Abgrenzung der verwandten Fumiquinazolone L-P (22-26) vorzunehmen. Außerdem wurden die neuen Alkaloide (20-26) bezüglich ihrer Zytotoxizität mittels der murinen Lymphomkarzinoms L5178Y überprüft, wo sie nur eine schwach bis keine Aktivität zeigten (bis zu einer Dosis von 10 µg/ml) Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Studie einunddreißig Verbindungen erfolgreich aus dem schwammassoziieren Pilz Aspergillus sp. identifiziert wurden, von den fünfzehn nach unserem besten Wissen, neue Naturstoffe sind (Tabelle 5.1). Marine microorganisms have proven to be a prolific source of structurally interesting and biologically active natural products. In particular, marine fungi have attracted considerable interest because of the diversity in chemical structures and biological activities observed for their secondary metabolites. Marine-derived fungi have been isolated from various organisms, including algae, mollusks and particularly sponges. However, sponge-associated fungi were found to be among the most prolific sources of bioactive compounds. Moreover, most compounds isolated from sponge-associated fungi displayed significant bioactivities in some pharmacological bioassay projects. Therefore, they could be interesting candidates offering lead structures for developing new drugs, primarily in the fields of anti-cancer, anti-inflammatory, anti-infective and analgesic drugs. Consequently, the aim of this work was to investigate and identify the secondary metabolites from the marine-derived fungus Aspergillus sp., isolated from the Mediterranean sponge Tethya aurantium, followed by examination of their pharmacological potential. Mass growth of the fungus for the isolation and identification of secondary metabolites was carried out on two different media, namely biomalt agar and spelt barley solid media for 21 days at 22℃. The cultures obtained from both media were then lyophilized, extracted with ethyl acetate, and the dry residues left after evaporation were defatted with petroleum ether. The resulting fraction was then subjected to different chromatographic separation techniques in order to isolate the secondary metabolites. The identification of the secondary metabolites was mainly performed using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) experiments to determine the molecular weight and structure, respectively. Moreover, in the case of selected optically active natural products, time-dependent density functional theory electronic circular dichroism (TDDFT ECD) calculations were employed in order to determine their absolute configuration. Eventually, all of the isolated compounds were subjected to various bioassays to screen their bioactivities, such as cytotoxic and antimicrobial activities. Chromatographic separation of the crude extract of the sponge-associated fungus Aspergillus sp. yielded eleven known polyketide-derived compounds (1-7, 16-18, and 28), six new meroterpenoid metabolites (10-14 and 29), twelve alkaloids including one new tryptoquivaline (20), six new fumiquinazolines (21-26), one novel tryptophan-derived alkaloid (31) as well as four known alkaloids (8, 9, 19, and 27), one novel biphenyl ether (30), and one known nucleoside (15). Most polyketide-derived compounds isolated in this study were citrinin derivatives. In addition, butyrolactone II (1) was isolated as the main secondary metabolite of the investigated Aspergillus sp. 4-Acetyl-3,4-dihydro-6,8-dihydroxy-5-methyl isocoumarin (5) exhibited pronounced cytotoxic activity against several selected cell lines, whereas the remaining polyketide-derived compounds showed either weak or no activity against L5178Y mouse lymphoma cell line. The new meroterpenoid compounds, austalides M-R (10-14 and 29), were found to be structurally related to the known austalides A-L previously isolated from Aspergillus ustus. Structural analysis of the austalides suggested a biosynthetic pathway which involves 6-farnesyl-5,7-dihydroxy-4-methylphthalide, a key intermediate in the biogenesis of mycophenolic acid. Furthermore, TDDFT ECD calculations of austalides M–Q (10-14), new metabolites of Aspergillus sp., have been presented. ECD calculations of these derivatives afforded their absolute configurations and also revealed that the conformation of the phthalide chromophore was governed by the central chirality elements and that the benzylic center is decisive for the characteristic ECD Cotton effects. The calculations also explain the remarkable difference in the ECD spectra of the structurally related austalides, and demonstrate why the absolute geometry cannot be determined by simple comparison of their ECD spectra. Finally, they showed either weak or no activity against L5178Y mouse lymphoma cell line. The known alkaloids 8, 9 and 19 were characterized for the first time from sponge-associated fungi, whereas previous studies reported their isolation from Aspergillus fumigatus obtained from sea mud, Aspergillus fumigatus collected from the air and dust of asthmatic patients’ rooms, and Trichoderma sp. isolated from bamboo leaves, respectively. Compounds 8 and 9 exhibited pronounced cytotoxicity against L5178Y mouse lymphoma cell line with IC50 values of 3.7 and 0.2 μM, respectively, whereas 19 showed weak activity in this assay. Furthermore, when tested against human cell lines 9 exhibited moderate activity against human ovarian cancer (A2780sens) and human Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia (K562) cell lines with IC50 values of 8.0 and 19.3 μM, respectively, whereas 8 exhibited only moderate to weak cytotoxic activity against K562, A2780sens, and A2780CisR cell lines with IC50 values of 15.0, 18.5 and 38.8 μM, respectively. Compounds 20-26 are new tryptoquivaline and fumiquinazoline alkaloids. The main structural difference between the new members reported in this study and previously reported compounds possessing the same molecular framework is the inclusion of a rare amino acid residue, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, instead of alanine or methylalanine residues as found in previously reported analogues. The absolute configurations of tryptoquivaline K (20) and fumiquinazolines K (21) were determined by TDDFT ECD calculations of their solution conformers and the ECD of the latter was used for the configurational assignment of the related fumiquinazolines L-P (22-26). In addition, the new alkaloids (20-26) were evaluated for their cytotoxicity against the murine lymphoma cancer cell line L517Y and they showed weak or no activity in this assay (up to a dose of 10 μg/mL). In conclusion, a total of thirty-one compounds were successfully identified from the sponge-associated fungus Aspergillus sp. in this study, to the best of our knowledge, fifteen of which were confirmed as new natural products (Table 5.1).
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	09.07.2012
Dateien geändert am:	09.07.2012
Promotionsantrag am:	23.05.2012
Datum der Promotion:	28.06.2012