Dokument: Die Regulation der frühen und der späten HIV-1 Genexpression durch alternatives prä-mRNA Spleißen
| Titel: | Die Regulation der frühen und der späten HIV-1 Genexpression durch alternatives prä-mRNA Spleißen | |||||||
| Weiterer Titel: | Regulation of early and late HIV-1 gene expression by alternative pre-mRNA splicing | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16717 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20101110-104638-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Asang, Corinna [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Schaal, Heiner [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | HIV-1, splicing, RNA | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das alternative Spleißen stellt einen bedeutenden Mechanismus für die zeitlich regulierte HIV 1 Genexpression dar, der für die virale Replikation unentbehrlich ist. Zahlreiche cis-wirkende Elemente beeinflussen die Prozessierung der viralen prä-mRNA zu unterschiedlichen mRNA-Isoformen, die die frühe, intermediäre und späte virale Genexpression kennzeichnen. Die vorliegende Arbeit untersuchte spleiß-regulatorische Mechanismen, die entweder die Bildung früher mRNAs oder die Expression genomischer RNA steuern.
Im ersten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass ein zuvor identifizierter, mehrere Bindestellen umfassender, purin-reicher exonischer Spleiß-Enhancer (GAR ESE) im Exon 5 durch die bidirektionale Aktivierung der jeweiligen 3’ ss und der 5’ ss für den Einschluss der internen alternativen Exons 4c, 4a, 4b und 5 in frühe rev- und nef-mRNAs entscheidend ist. Es wurde erkannt, dass der GAR ESE eine doppelte spleiß-regulatorische Funktion ausübt, indem er (i) den internen Exon-Einschluss durch alle identifizierten Bindestellen für die SR-Proteine SF2/ASF und SRp40 synergistisch steigert und (ii) innerhalb der 3’ ss-Gruppe stromaufwärts des Exons 5 die 3’ ss A5 ausschließlich durch die proximalen SF2/ASF-Bindestellen spezifisch aktiviert. Die GAR ESE-vermittelte 3’ ss Selektivität wird vermutlich durch die phosphorylierungs-abhängige Stabilisierung von U2AF65 stromaufwärts der 3’ ss A5 ausgeübt. Als weitere mögliche Faktoren für den GAR ESE-abhängigen Exon-Einschluss wurden die spleiß-regulatorischen Proteine hTra2-, hnRNP H und hnRNP Q identifiziert. Es wurde beobachtet, dass der interne Exon-Einschluss zusätzlich auf stromabwärts gelegene Elemente des Exons 5, der 5’ ss D4 und der E42-Sequenz, angewiesen ist. Dies spricht für ein regulatorisches Netzwerk, das sich über das Exon 5 spannt. Diese Interaktionen sind auch für die Prozessierung intron-haltiger vpu/env-mRNAs essentiell. Daher reguliert der GAR ESE das Spleißen der viralen prä-mRNA sowohl in der frühen als auch in der intermediären Phase der HIV 1 Genexpression. Im zweiten Teil dieser Arbeit offenbarte die Suche nach spleiß-regulatorischen Elementen, die für die Expression genomischer HIV-1 RNA verantwortlich sind, dass die mit der 5’ ss D1 überlappenden Bindestellen für die SR-Proteine SC35 und SRp55, die Nutzung dieser Spleißstelle reduzieren. Im Gegensatz dazu verstärkte die Bindung der RS-Domäne von SC35 in einer nicht-überlappenden stromaufwärts gelegenen Position das Spleißen an D1. Dies deutet darauf hin, dass eine Konkurrenz zwischen SR-Proteinen und spleißosomalen Komponenten um die Bindung an den D1 besteht. Dieses Modell wurde durch die Beobachtung erhärtet, dass die weiter stromaufwärts des D1 liegenden Bindestellen für SR-Proteine und hnRNP H die Nutzung der 5’ ss nicht beeinflussen. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass D1-flankierende Sequenzen die interne 3’ ss Auswahl und das Spleißen des distalen Introns beeinflussen. Jedoch reicht der regulatorische Einfluss der dem D1 benachbarten Sequenzen vermutlich nicht aus, um den beachtlichen Anstieg der Menge vollständig ungespleißter RNA in der späten Phase der viralen Genexpression herbeizuführen. Ein wesentlicher spleiß-regulatorischer Effekt des viralen Proteins Gag auf das Spleißen der HIV 1 mRNA konnte nicht bestätigt werden. Hingegen wurde erkannt, dass das p17-ins Element stromabwärts des D1 durch die Wirkung als intronischer Spleiß-Enhancer das Spleißen an dieser Stelle kontrolliert. Zugleich ist dieses Element für die Rev-abhängige Expression vollständig ungespleißter RNA, aber nicht intermediärer vpu/env-mRNAs, entscheidend. Daher scheinen sich intron-haltige intermediäre und späte virale mRNAs in ihren Sequenzvoraussetzungen für die Rev-Abhängigkeit zu unterscheiden. Dies könnte die molekulare Ursache für die verzögerte Expression der vollständig ungespleißten genomischen HIV 1 mRNA sein.Alternative splicing is a major mechanism for temporally regulated HIV-1 gene expression essential for viral replication. Numerous cis-acting elements affect viral pre-mRNA processing into distinct mRNA isoforms characterising early, intermediate and late viral gene expression. This thesis investigated splicing regulatory mechanisms controlling either the generation of early mRNAs or the expression of genomic RNA. In the first part of this work a previously identified purine-rich multisite exonic splicing enhancer (GAR ESE) located in exon 5 was shown to be crucial for inclusion of the alternative exons 4c, 4a, 4b and 5 into early rev- and nef-mRNAs by bidirectionally activating the respective 3’ ss and the 5’ ss. The GAR ESE was found to perform a dual splicing regulatory function (i) by synergistically enhancing internal exon inclusion through all identified binding sites for the SR proteins SF2/ASF and SRp40, and (ii) by specifically activating A5 of the 3’ ss cluster upstream of exon 5 solely by the proximal SF2/ASF binding sites. GAR ESE-mediated 3’ ss selectivity is likely exerted by phosphorylation-dependent stabilisation of U2AF65 upstream of 3’ ss A5. For GAR ESE-dependent exon inclusion the splicing regulatory proteins hTra2-, hnRNP H and hnRNP Q were identified as further candidate factors. Internal exon inclusion was observed to additionally depend on downstream elements of exon 5, i.e. 5’ ss D4 and the E42 sequence indicating a regulatory network spanning across exon 5. These interactions are also essential for processing of intron-containing vpu/env-mRNAs. Therefore, the GAR ESE regulates viral pre-mRNA splicing in the early as well as in the intermediate phase of HIV 1 gene expression. In the second part of this thesis, searching for splicing regulatory elements responsible for the expression of genomic HIV 1 RNA revealed that binding sites for the SR proteins SC35 and SRp55 partly overlapping D1 reduce 5’ ss efficiency. In contrast, tethering the SC35 RS domain into a non-overlapping upstream position enhanced splicing at D1 indicating a competition of SR proteins and spliceosomal components for binding to D1. This model was substantiated by the finding that binding sites for SR proteins and hnRNP H further upstream of D1 did not affect 5’ ss usage. In addition, sequences flanking D1 were found to affect internal 3’ ss selection and distal intron removal. However, the regulatory impact of the sequences neighbouring D1 is likely not sufficient to mediate the striking increase in the level of completely unspliced RNA in the late phase of viral gene expression. A significant effect of the viral protein Gag on splicing of the HIV 1 mRNA could not be confirmed. In contrast, the p17-ins element downstream of D1 was found to control splicing at D1 by acting as intronic splicing enhancer. At the same time, this element is essential for Rev-dependent expression of completely unspliced mRNA, but not for intermediate vpu/env-mRNAs. Therefore, intron-containing intermediate and late viral mRNAs appear to differ in their sequence requirements for Rev-dependency. This might represent the molecular basis for the delayed expression of completely unspliced genomic HIV 1 mRNA. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.11.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.11.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 21.06.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 27.10.2010 |
