Dokument: Synthese heterologer Membranproteine und Carotinoide in dem phototrophen Bakterium Rhodobacter capsulatus

Titel:	Synthese heterologer Membranproteine und Carotinoide in dem phototrophen Bakterium Rhodobacter capsulatus
Weiterer Titel:	Synthesis of heterologous membrane proteins and carotenoids in the phototrophic bacteria Rhodobacter capsulatus
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10668
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090324-102451-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Heck, Achim [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,22 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.03.2009 / geändert 17.03.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	membrane protein, heterologous, carotenoid, Rhodobacter capsulatus, bacterioopsin, squalenepoxidase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die funktionelle Expression heterologer Membranproteine ist für viele wissenschaftliche und biotechnologische Anwendungen von besonderem Interesse. Leider ist jedoch die Synthese von Membranproteinen in Standardexpressionswirten wie z.B. E. coli nicht ohne weiteres möglich. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob die Verwendung eines alternativen Expressionssystems, das auf dem phototrophen Bakterium R. capsulatus basiert, für die Expression solcher Problemproteine besonders geeignet ist. Im Gegensatz zu E. coli weist R. capsulatus unter phototrophen Bedingungen eine stark vergrößerte Cytoplasma-Membran auf, die eine große Anzahl verschiedener Photosyntheseproteine beherbergt und somit grundsätzlich großen Mengen an Membranproteinen synthetisieren und akkumulieren kann. Voraussetzung für die Synthese heterologer Membranproteine in R. capsulatus ist ein etabliertes Expressionssystem, das die heterologe Überexpression beliebiger Zielgene unter phototrophen Wuchsbedingungen erlaubt. Ein solches Expressionssystem wurde mit dem Expressionsvektor pRhotHi-2, der die Zielgenexpression unter der Kontrolle des T7-Promotors aus dem T7-Phagen erlaubt, und dem Expressionsstamm R. capsulatus B10S-T7 realisiert. Dieser Expressionsstamm trägt das T7-RNA-Polymerasegen als stabile chromosomale Integration unter der Kontrolle eines Fruktose-induzierbaren Promotors (Pfru). Mit Hilfe dieses Expressionssystems wurde untersucht, inwieweit R. capsulatus in der Lage ist, unter photoheterotrophen Anzuchtbedingungen heterologe Membranproteine wie z.B. das Bacterioopsin und die Squalenepoxidase zu synthetisieren. Als Referenzsysteme wurden die beiden E. coli Expressionsstämme BL21(DE3) und C43(DE3) verwendet. Mit Hilfe quantitativer real-time-PCR Methoden konnte gezeigt werden, dass sowohl das Transkript des Squalenepoxidase-Gens sqep als auch des Bacterioopsin-Gens bop in R. capsulatus in deutlich größeren Menge akkumuliert als in den entsprechenden E. coli Expressionsstämmen. Anhand immunologischer Nachweismethoden konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass in R. capsulatus beide heterologen Membranproteine in der Zellmembran akkumulieren, während sich E. coli lediglich Bacterioopsin in geringen Mengen funktionell exprimieren ließ. Mit einer analytischen Dichtegradientenzentrifugation konnte außerdem nachgewiesen werden, dass sowohl die Squalenepoxidase als auch das Bacterioopsin ausschließlich in den Photosynthese-Vesikeln der R. capsulatus Membran in großen Mengen (> 2mg) akkumulierten und so sehr einfach isoliert für weiter Anwendungen charakterisiert werden können. Aufgrund der besonderen physiologischen Eigenschaften von R. capsulatus kann dieser Organismus außerdem zur Produktion von Carotinoiden eingesetzt werden. Daher wurde untersucht, inwieweit die Carotinoid-Ausbeute in R. capsulatus durch eine Veränderung der Belichtungsbedingungen gesteigert werden kann. Dabei stellte sich heraus, dass durch eine gezielte Beleuchtung der Zellen mit blauem und/oder infrarotem Licht die Carotinoidkomposition und Carotinoidmenge beeinflusst wird. Insbesondere führt die Einstrahlung von blauem Licht zu einer deutlichen Steigerung der Carotinoidmenge im untersuchten Testsystem. The functional expression of heterologous membrane proteins is of enormous scientific and biotechnological interest. Unfortunately, the synthesis of membrane proteins in standard expression hosts such as E. coli is not possible without further ado. Therefore, the application of an alternative expression system that bases on the phototrophic bacteria R. capsulatus was analyzed with respect to synthesis of heterologous membrane proteins. This expression system exhibits a strongly enlarged membrane system when cultivated under phototrophic growth conditions that harbours a huge number of photosystem proteins. This membrane system is also potentially able to incorporate heterologous membrane proteins. However, prerequisite for the synthesis of heterologous membrane proteins in R. capsulatus is an expression, allowing the heterologous over-expression of any target gene under phototrophic growth conditions. Such a system was realized by developing the expression vector pRhotHi-2, allowing the target gene expression under the control of the T7 promoter, and the expression strain R. capsulatus B10S-T7. This expression strain carries the T7-RNA-polymerase gene under the control of a promoter that can be induced by fructose (Pfru). Using this expression system, it has been analyzed if R. capsulatus can be used to express the heterologous membrane proteins Bacterioopsin and Squalenepoxidase under phototrophic growth conditions. In addition, standard E. coli expression strains have been used as an appropriate reference system. First, transcript accumulation in the different expression hosts was analyzed. Quantitative real-time PCR revealed that in R. capsulatus both the transcript of the Bacterioopsin gene bop as well as the Squalenepoxidase gene sqep accumulated in much higher amounts in comparison to the E. coli strains. Furthermore, protein localization studies demonstrated that R. capsulatus was able to insert both membrane proteins into the membrane whereas in E. coli, only Bacterioopsin was detectable in the membrane fraction in low amounts. Finally, by using Saccharose gradient ultracentrifugation, membrane vesicles, containing the heterologous membrane proteins with a yield of more than 2 mg could easily be separated from other membrane components helping to further characterize those proteins, subsequently. Because of its unique physiological properties, R. capsulatus can also be used to produce different Carotinoids. Therefore, it has been analyzed if changes of the illumination conditions result in an enhanced synthesis of these photo pigments. By using different LEDs, emitting light in the blue and/or infrared range, a change of the composition and amount of Carotinoids could be observed in R. capsulatus. Remarkably, phototrophic growth under blue light led to a significant increase of Carotinoid accumulation in the used test system.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	18.03.2009
Dateien geändert am:	17.03.2009
Promotionsantrag am:	01.12.2008
Datum der Promotion:	26.01.2009